Skripta Speciální diagnostika

větší je rozdíl elučních časů či objemů a čím menší je
šířka pásů (píků). Přístroj s registrací vnějšího chromatogramu se nazývá chromatograf.
Adsorpční chromatografie
Dělení složek směsi je založeno na různé afinitě adsorbentu k molekulám mobilní fáze a
k molekulám dělených složek.
Největší uplatnění má adsorpční chromatografie v kapalinové chromatografii sloupcové a na
tenkých vrstvách (→tenkovrstvá chromatografie). V plynové chromatografii se adsorpční
chromatografie používá především pro dělení nízkomolekulárních plynů, např. kouřových
plynů na aktivním uhlí.
Adsorpce
Proces probíhající na povrchu pevné nebo kapalné látky a spočívající v růstu povrchové
koncentrace molekul adsorbované látky (adsorbátu), jíž může být plyn nebo látka rozpuštěná
v roztoku. Adsorpce molekul adsorbátu na adsorbentu je způsobena vazebními silami mezi
částicemi povrchu adsorbentu a molekulami adsorbátu, které na povrch dopadají. Vázaná
molekula setrvává na povrchu určitou dobu (tzv. dobu pohybu), která závisí na vazebné
energii a teplotě. Po uplynutí této doby molekula povrch opouští → desorbuje.

8 Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií VUT v Brně

Gelová chromatografie
Metoda kapalinové chromatografie, při níž se látka rozděluje mezi volné rozpouštědlo
v mobilní fázi a totéž rozpouštědlo uzavřené v pórech pevné stacionární fáze. K rozdělení
látek při eluaci se využívá jejich nestejné schopnosti pronikat do pórů gelu.
Gelová chromatografie má zásadní význam pro frakcionaci makromolekul přirozených i
syntetických látek. Stacionární fáze → např. anorganické gely (upravený silikagel, pórovité
sklo).
Rozpouštědlo → např. chloroform, benzen, toluen → neovlivňují rozlišení, mají pouze úlohu
rozpouštědla a nosného prostředí.
Chromatografie na měničích iontů
Principem dělení je výměna iontu mezi vzorkem v mobilní fázi a stacionární fází → tou jsou
zpravidla pevné, event. gelovité materiály (s charakterem měniče iontů → podle své povahy
mohou vyměňovat buď kladné nebo záporné ionty. Mobilní fází bývá nejčastěji voda.
Rozdělovací chromatografie
Fyzikální separační metoda selektivního dělení složek směsi. Má kapalnou stacionární fázi,
která je mechanicky zachycena (zakotvena) jako tenký film na vhodném inertním nosiči nebo
je chemicky vázána na povrchu nosiče.
Výhodou rozdělovací chromatografie je lineární isoterma, tj. distribuční koeficient nezávisí
v širokém rozmezí koncentrací na koncentraci distribuované látky.
Plynová chromatografie
Soubor chromatografických metod, u kterých je pohyblivou fází plyn.
Podle stacionární fáze je dělíme na:
- chromatografii plyn-kapalina (stacionární fází je kapalina) → rozd ělovací
chromatografie
- chromatografie plyn – pevná látka (stacionární fází je pevná látka – adsorbent,
[příp. molekulové síto]) → adsorp ční chromatografie
Plynovou chromatografií lze dělit takové látky, které je možno bez rozkladu převést do
plynného stavu, netěkavé látky lze stanovit po převedení na těkavé deriváty nebo jako plynné
produkty jejich pyrolytického rozkladu.
Registrační záznam chromatofrafického děje → chromatogram – lze vyhodnotit jak
kvalitativně (nejčastěji metodou retenčního indexu), tak i kvantitativně z úměrnosti mezi
intenzitou signálu detektoru (např. z plochy chromatografického píku) a koncentrací látky.
Vhodným spojením z analytického hlediska je spojení plynového chromatografu
s hmotnostním spektrometrem.
Kapalinová chromatografie
Dělicí metody, u kterých je pohyblivou fází kapalina. Podle experimentálního uspořádání
dělíme metody kapalinové chromatografie na
- metody se sloupcovou neboli kolonovou technikou
- metody s plošnou technikou (např. ch. na papíře, na tenkých vrstvách)
Kapalinovou chromatografií lze dělit směsi nejrůznějších pevných a kapalných látek, resp.
v kapalné fázi. Kapalinová chromatografie využívá všech dvoufázových separačních
mechanismů (adsorpce, chemisorpce, výměny iontů, rozdělení mezi dvě vzájemně
Speciální diagnostika 9
nemísitelné kapaliny, pronikání molekul z volně pohyblivé fáze do stejné kapalné fáze
uzavřené v pórech pevné nepohyblivé fáze).

































10 Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií VUT v Brně

2 Optická mikroskopie
2.1 Mikroskopie
je v širším smyslu odvětví aplikované fyziky, které pomocí mikroskopu zobrazuje struktury
menší než je rozlišovací schopnost lidského oka, v užším smyslu technická práce
s mikroskopem.
Je to souhrnný název pro četné, často velmi jemné a nesnadné metody, jichž se používá při
práci s mikroskopem. Jde o přípravu k pozorování i o další manipulace pod mikroskopem.
Mikroskopie byla přivedena k dokonalosti zavedením mikromanipulátorů – mechanické
zařízení uskutečňující jemné pohyby, na které již nestačí jemnost a jistota ruky.
Mikromanipulátory se používají nejen v technice, ale i v biologii, lékařství apod., např.
k izolaci jediné předem vybrané buňky.
Mikroskop
je přístroj k pozorování předmětů nepatrných rozměrů pod zorným úhlem zvětšeným optickou
cestou a k přesnému měření. Spojnou čočkou (objektivem) zvětšený obraz předmětu se
pozoruje další spojnou čočkou (okulárem) jako lupou - paprskový (optický) mikroskop.
Elektronový mikroskop - místo se světlem pracuje s proudem elektronů (ve vakuu), který je
ekvivalentní záření velmi malé vlnové délky.
První mikroskop byl sestrojen kolem r. 1590 v Nizozemsku.
Optická mikroskopie – slouží (jako jedna ze základních metod) ke studiu mikroskopických
předmětů a jejich struktur tím, že poskytuje zvětšený obraz zkoumaného předmětu.
Optické mikroskopy – využívají zobrazování soustavou čoček, pro něž platí zákony světelné
optiky. Kromě omezeného zvětšení nemá optický mikroskop žádné zvláštní nevýhody,
naopak jeho předností je snadná obsluha a údržba. Zvětšení mikroskopu se mění po skocích
(od desetinásobného po tisícinásobné).
2.2 Konstrukční schéma mikroskopu
Na rozdíl od lupy má mikroskop dvě optické části, které jsou funkčně i stavebně odlišeny –
objektiv a okulár.
Objektiv – soustava čoček umístěná poblíž pozorovaného předmětu (objektu). Pozorovaný
předmět leží před ohniskem F
1
objektivu v tzv. předmětové rovině. Světelné paprsky,
dopadající na pozorovaný předmět, jsou povrchem odráženy do objektivu. Po průchodu
objektivem vytvoří světelné paprsky v mikroskopu skutečný zvětšený převrácený obraz
předmětu – tento obraz musí ležet v přední ohniskové rovině okuláru. Okulárem pozorujeme
tento obraz jako lupou.
Okulár – soustava čoček, kterou pozorujeme obraz vytvořený objektivem. Při pohledu do
okuláru mikroskopu pozorujeme tedy zvětšený neskutečný převrácený obraz předmětu.
Výsledný obraz leží pro neakomodované oko (akomodace oka – samovolné přizpůsobení oka
vzdálenosti pozorovaného předmětu; je to schopnost oční čočky změnou zakřivení lámavých
ploch vytvořit ostré obrazy vzdálených a blízkých předmětů na sítnici) v nekonečnu, ale
abychom si mohli vyjádřit jeho velikost, představujeme si jej promítnutý v konvenční zrakové
vzdálenosti, tj. 250 mm od oka.
Obě soustavy mají vzájemnou vzdálenost určenou délkou kovové trubice (tubusu)
(160 – 170 ) mm, jejímž posouváním dvěma šrouby (hrubý a jemný posuv) se zaostřuje na
předmět.
Speciální diagnostika 11
Vznik obrazu v mikroskopu (konstrukce obrazu v mikroskopu)



Obr. 2.1 Konstrukce obrazu v mikroskopu
Při fotografování je potřeba, aby okulár vytvořil skutečný obraz na matrici fotografické m
filmu. Potřebný reálná obraz získáme tak, že při zachování optické osy posuneme okulár tak,
aby obraz vytvořený objektivem ležel před přední ohniskovou rovinou okuláru. Při
fotografování má tedy okulár funkci projektoru a obraz je okulárem promítnut do roviny
filmu.
Objektivy a jejich rozdělení
Podle principu zobrazení
Čočkové objektivy - zobrazování je založeno na lomu světelných paprsků. Čočkové optické
soustavy jsou častější
Zrcadlové objektivy - zobrazování je založeno na odrazu světelných paprsků. Zrcadlové
objektivy bývají nazývány též reflexní.
Podle prostředí mezi pozorovaným předmětem a objektivem
Suché objektivy (čočkové) – mezi pozorovaným předmětem a objektivem je vzduch.
Imerzní objektivy (čočkové) – mezi čelní čočkou objektivu a pozorovaným předmětem je
tekutina, která má index lomu shodný s indexem lomu skla čelní čočky objektivu. Obvykle
se používá cedrový olej s indexem lomu n = 1, 515 (index lomu skla je n = 1, 53 – běžná
tvrdá skla, n = 1, 6 - olovnatá skla).
12 Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií VUT v Brně

Podle způsobu odstranění optických vad
Achromatické objektivy (čočkové) – jsou složeny ze dvou až šesti čoček.
Barevná vada – při průchodu světla čočkou dochází k rozkladu bílého světla na jednotlivé
složky, jelikož index lomu závisí na vlnové délce světla. Protože se fialové paprsky lámou
více než červené, láme se svazek bílých paprsků rovnoběžných s optickou osou do řady
ohnisek. Vzniklý obraz je ostrý pouze pro jednu barvu a je ohraničen jinými barvami. To je
tzv. barevná (chromatická) vada čočky. Protože každé barvě přísluší jiná hodnota
ohniskové vzdálenosti, jsou obrazy předmětů, zobrazované jednotlivými barvami, různě
velké.
U achromatických objektivů je barevná vada odstraněna pro dvě spektrální barvy, konkrétně
pro žlutou a zelenou, s těžištěm korekce 550 až 590 nm. Neopraven zůstává malý zbytek
chromatické vady v modrofialové a červené oblasti spektra. Achromatické objektivy jsou
v optické mikroskopii nejpoužívanějším druhem objektivů. Při fotografování se těchto
objektivů používá ve spojení se žlutozelenými filtry. Obrazové pole objektivů je
zakřivené, sklenuté, podobně jako sítnice oka
- Planachromatické objektivy (čočkové) – jsou korigovány pro dvě spektrální barvy
(podobně jako achromatické), ale mají menší zakřivení zobrazovaného pole. Jsou vhodné
pro fotografování mikroskopických objektů.
- Apochromatické objektivy (čočkové) – jsou korigovány pro tři spektrální barvy tak, že
obrazy vytvářené červenými, žlutými a modrými paprsky sezobrazují v jedné rovině
(obraz vytvořený modrými paprsky je však většínež obraz červený). Vada se snižuje
použitím tzv. kompenzačního okuláru. Při použití apochromatických objektivů je aplikace
kompenzačního okulárunezbytná. Předností apochromatického objektivu je vysoká
numerická (číselná) apertura. Proto mají větší rozlišovací schopnost a světelnost než jiné
druhy objektivů. Obrazové pole apochromatických objektivů je zakřivené podobně
jako sítnice oka.
- Planapochromatické objektivy (čočkové) – jsou apochromatické objektivy, u
nichž je odstraněno sklenutí obrazového pole.
Okuláry a jejich rozdělení
Okulár je soustava dvou nebo více čoček, pomocí které pozorujeme zvětšený obraz
vytvořený objektivem. Čočka bližší oku pozorovatele se nazývá očnice, čočka bližší k objektu
se nazývá kolektiv. Mezi kolektivem a očnicí je kruhová clona omezující zorné pole – nazývá
se polní clona mikroskopu. U některých speciálních okulárů jsou v rovině polní clony
umístěny záměrné kříže (zvané též nitkové kříže), ukazovací jehly, stupnice apod.
Podle konstrukce rozlišujeme
- Huygensův okulár je nejjednodušší a nejběžnější typ okuláru. Je tvořen dvěma
ploskovypuklými (plankonvexními) čočkami. Používá se ve spojením se slabě zvětšujícím
achromatickým, planachromatickým nebo apochromatickými objektivy.
- Ortoskopický okulár je tříčočková optická soustava, očnice je sestavena ze dvou čoček.
Ortoskopický okulár je lépe korigován než Huygensův a má o třetinu větší zorné pole.
Používá se ve spojení s achromatickým nebo planachromatickým objektivem.
- Periplanatický okulár je tříčočková optická soustava sestavená tak, že částečně
kompenzuje zbytkovou chromatickou vadu objektivů. Zčásti vyrovnává sklenutí zorného
pole a lze jej použít při fotografování.
Speciální diagnostika 13
- Kompenzační okulár je až čtyřčočková optická soustava, která má úmyslně
zavedenu chromatickou vadu zvětšení, ale opačnou než apochromatické objektivy. Používá
se především ve spojení s apochromatickým bjektivem, neboť kompenzuje barevnou vadu
zvětšení tohoto objektivu.
2.3 Charakteristické hodnoty mikroskopu
Patří k nim
- celkové zvětšení mikroskopu
- rozlišovací schopnost
- hloubková ostrost
Celkové zvětšení mikroskopu je rovno součinu vlastního zvětšení okuláru a objektivu.
Vlastní zvětšení okuláru je dáno poměrem velikosti subjektivního, neskutečného obrazu,
předpokládaného v konvenční vzdálenosti 250 mm od oka, k velikosti obrazu umístěného
v přední ohniskové rovině okuláru. Hodnota vlastního zvětšení okuláru je zpravidla uvedena
na objímce okuláru.
Vlastní zvětšení objektivu je dáno poměrem velikosti skutečného obrazu, vytvořeného
objektivem v obrazové rovině, k velikosti zobrazeného předmětu. Při spojení mikroskopu
s fotografickou kamerou se skutečné zvětšení obrazu stanoví pomocí objektivového
mikrometru. Objektivový mikrometr je skleněná, příp. kovová destička, na níž je 1 mm
rozdělen na 100 dílků. Poměr mezi velikostí dílku vyobrazeného na filmu nebo matnici
kamery a skutečnou velikostí délky určuje celkové zvětšení obrazu.
Maximální užitečné zvětšení, rozlišovací schopnost a hloubková ostrost závisí na
množství paprsků, které je objektiv schopen zachytit. Úhel mezi nejkrajnějšími paprsky
odraženými od předmětu, které jsou objektivem ještě zachyceny a zužitkovány, se nazývá
otvorový úhel objektivu 2σ
0
. Čím je otvorový úhel větší, tím je větší množství paprsků
vstupujících do objektivu. Otvorový úhel nemůže nikdy dosáhnout

hodnoty 180 °, platí tedy
σ
0
< 90 °. Množství paprsků vstupujících do objektivu závisí na prostředí mezi pozorovaným
předmětem a čelní čočkou objektivu, tzn., závisí na indexu lomu předmětového prostoru.
Součin indexu lomu n předmětového prostoru a sinu polovičního otvorového úhlu objektivu
nazýváme numerickou aperturou objektivu A, která je dána vztahem A = n . sin σ
0
.
Pro suché objektivy (prostředím předmětového prostoru je vzduch) je n = 1 (index lomu
vzduchu) – maximální hodnota numerické apertury proto nepřesahuje hodnoty 0,9 – 0,95. Pro
imerzní objektivy (index lomu cedrového oleje je n = 1, 515) lze dosáhnout hodnoty
numerické apertury objektivu až A = 1,4.
Maximální užitečné zvětšení mikroskopu závisí na vlastnostech objektivu. Pro každý
objektiv existuje horní hranice celkového zvětšení mikroskopu. Při větším zvětšení dostaneme
sice větší obraz, ale další detaily pozorovaného objektu nezjistíme. Toto další zvětšení se
nazývá prázdné.
Podle Abbéových rozborů (Abbé E. – německý fyzik, profesor na vysoké škole
v Jeně , spolupracoval s firmou Zeiss na konstrukci optických přístrojů) je užitečné zvětšení
objektivu (500 až 1 000) . A (tj. pětiset- až tisícinásobek numerické apertury).
Z obrázku konstrukce obrazu v mikroskopu je vidět, že okulár zvětšuje obraz vytvořený
objektivem. To znamená, že okulárem nemůžeme zjistit detaily, které nezobrazí objektiv.
Znamená to tedy, že rozlišovací schopnost mikroskopu, tj. schopnost mikroskopu rozlišit
detaily předmětu, je dána konstrukcí objektivu.
14 Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií VUT v Brně

Rozlišovací schopnost mikroskopu je definována jako nejmenší vzdálenost dvou bodů
předmětu, které jsou mikroskopem od sebe jasně rozlišitelné jako dva body.
Pro rozlišovací schopnost objektivu d
0
při použití kolmého osvětlení úzkým svazkem
paprsků platí d
0
= λ / A, kde A … je numerická apertura objektivu
λ … je vlnová délka záření.
Při kolmém osvětlení kuželem paprsků, majícím numerickou aperturu A
0
,

pro rozlišovací
schopnost objektivu platí d
0
= λ / (A + A
0
).
Obvykle se osvětlení seřizuje tak, že numerická apertura osvětlení A
0
je shodná
s numerickou aperturou objektivu. Pak d
0
= λ / 2A.
Z uvedených vztahů vyplývá, že čím je kratší vlnová délka světla použitého pro osvětlení
předmětu, tím menší částečky předmětu můžeme rozlišit.
Např. při λ = 0, 55 µm (infračervené záření) a A = 0,30 rozlišíme dva body vzdálené
d
0
= λ / 2A = 0, 92 µm. Potřebujeme-li větší rozlišovací schopnost, použijeme např. imerzní
objektiv s A = 1, 4. Potom d
0
= 0, 20 µm. Nepostačí-li ani tato rozlišovací schopnost, musíme
použít elektronový rastrovací mikroskop.
V praxi je často obtížné dosáhnout teoretické maximální rozlišovací schopnosti,
neboť rozlišovací schopnost mikroskopu závisí na způsobu a kvalitě seřízení osvětlení.
Doposud jsme neuvažovali, zda rozlišovací schopnost mikroskopu dokáže naše oko
využít. Rozlišovací schopnost zdravého oka činí jednu úhlovou minutu. Přirozenou únavou
oka se zmenší na 4, 5 úhlové minuty. Této hodnotě odpovídá při konvenční zrakové
vzdálenosti 250 mm vzdálenost 0, 327 mm. Použijeme-li mikroskop s celkovým zvětšením
Z, můžeme rozlišit detaily předmětu o velikosti 0,327 / Z mm. Podmínkou je, aby takové
rozlišení umožnil také objektiv. Z toho důvodu má Abbéův vztah pro užitečné zvětšení kromě
horní meze také spodní mez.
Jako pravidlo je vhodné si zapamatovat, že při celkovém zvětšení menším než (500 . A)
nevyužijeme rozlišovací schopnost objektivu, neboť okulár nezvětší obraz vytvořený
objektivem natolik, aby v něm naše oko rozlišilo zobrazené detaily.
Hloubková ostrost – při pozorování neprůsvitných zvrásněných povrchů nebo
transparentních předmětů potřebujeme vidět ostře současně všechny body předmětu, které
máme v zorném poli, bez ohledu na jejich výškovou polohu. Z toho důvodu nás zajímá
hloubková ostrost mikroskopu.
Hloubková ostrost mikroskopu je dána hloubkou vrstvy, ve které je možno vidět současně
všechny body pozorovaného objektu s dostatečnou ostrostí, bez ohledu na jejich výškovou
polohu ve vrstvě. Pro hloubkovou ostrost platí h = K / (Z . A) ,
kde K … je konstanta
Z … je celkové zvětšení mikroskopu
A … je numerická apertura objektivu.
Z tohoto vztahu je zřejmé, že velkou hloubkovou ostrost dosáhneme při malých
hodnotách zvětšení a malé numerické apertuře.
Před každým pozorováním je tedy potřebné zvážit, jakou kombinaci okuláru a objektivu
použijeme. Není správná laická představa, že čím větší zvětšení použijeme, tím více informací
o detailech struktury získáme.
Speciální diagnostika 15
2.4 Osvětlovací soustava
Osvětlovací soustava mikroskopu sestává zpravidla z těchto částí:
- světelný zdroj
- kondenzor
- irisová aperturní clona
- systém čoček
- irisová polní clona.
Světelný zdroj - jako světelný zdroj může sloužit
- nízkovoltová tzv. projekční žárovka
- oblouková lampa
- vysokotlaká rtuťová výbojka
- vysokotlaká xenonová výbojka
- halogenová lampa
Kondenzor soustřeďuje světlo ze světelného zdroje. Kondenzor tvoří krátkoohnisková
čočková soustava určité apertury. Hodnota apertury je vyznačena na objímce.
Irisová aperturní clona (irisový = duhový /z řečtiny/)
Irisová clona umožňuje zužovat podle potřeby kruhový otvor, podobně jako duhovka v oku
zužuje zornici.
Irisová aperturní clona řídí aperturu osvětlení, tj. vrcholový úhel kužele světelných
paprsků přicházejících ze zdroje a tím ovlivňuje rozlišovací schopnost mikroskopu
d
0
= λ / (A + A
0
). Aperturní clonu nepoužíváme k řízení jasu obrazu, jelikož přivřením
aperturní clony snížíme rozlišovací schopnost mikroskop