Přednáška

Analýza sekvence (sekvenování, RFLP, …) Na úrovni transkripce genu:
Množství mRNA (Northern blot, RT-PCR, QRT-PCR, chip analýza,
hybridizace in situ) Na úrovni exprese a funkce proteinu:
Celkové množství regulátoru (Western blot, imunodetekce in situ)
Asociace regulátoru s jeho partnery (imunoprecipitace)
Aktivita (stanovení kinázové aktivity in vitro)
Jiné aspekty metabolismu, např. poločas života (metabolické značení) cyklin E v jádrech buněk
karcinomu prsu Sofistikované experimentální způsoby analýzy
významu/funkce regulátorů buněčného cyklu: Genetické modifikace
Ektopická exprese – transgeneza
Zvýšení exprese
Exprese mutantních forem (např. dominantně negativní mutanti)
Genový „knockout“ a „knockin“ homologní rekombinací
Genový „knockdown“ s využitím siRNA strategie
Exprese značených proteinů umožňujících jejich sledování in vivo
Jiné V buňkách kultivovaných in vitro U zvířat (myš, Drosophila, …) Analýza fenotypu na všech možných úrovních Co jsme se dosud dozvěděli?
&
Důležité pro zapamatování: Protein Funkce Defekt(y) Typ nádoru
p16 Inhibitor Cdk4/6 Delece ~95% T-cell ALL
Bodová mutace ~75% Melanom
Umlčení ~75% Karcinom pankreatu
~52% Karcinom jícnu
12 - 30% Karcinom plic
~30% Gliom
~20% Karcinom močového měchýře
Sporadický melanom
~95% Nádorové buněčné linie
p18 Inhibitor Cdk6 DeleceAkutní lymfoidní leukémie
Bodová mutace Karcinom prsu
p21 Inhibitor Cdk Snížená exprese Buněčné linie dificientní v p53
p27 Inhibitor Cdk Degradace Karcinom prsu
Kolorektální karcinom
cdk1 Katalytická podjednotka Zvýšená exprese Karcinom prsu
Karcinom prostaty
Kolorektální karcinom
Karcinom žaludku U lidských malignit se vyskytují různé defekty regulátorů buněčného cyklu:
(adaptováno z: Webster, K.R., Exp. Opin. Invest. Drugs, 1998) Protein Funkce Defekt(y) Typ nádoru
cdk2 Katalytická podjednotka Zvýšená exprese Kolorektální karcinom
cdk4 Katalytická podjednotka Amplifikace Sarkom, gliom
Bodová mutace Melanom
Zvýšená exprese Adenomatózní polypóza
Cyclin A Aktivátor cdk1/2 Stabilizace Karcinom jater
Cyclin B1 Aktivátor cdk1Zvýšená exprese 88% Kolorektální karcinom
Cyclin D1 Aktivátor cdk4/6 Amplifikace 40 - 80% Karcinom prsu
Zvýšená exprese ~70% Adenomatózní polypóza
50% B-buněčný lymfom
~47% Karcinom plic
~35% Karcinomy hlavy a krku
25 - 50% Karcinom jícnu
~25% Karcinom močového měchýře
Cyclin E Aktivátor cdk2 Amplifikace~90% Kolorektální karcinom
Zvýšená exprese 30 - 80% Karcinom prsu
~70% Karcinom prostaty
~18% Karcinom vaječníků
Karcinom žaludku Většina kanonických komplexů cyklin/cdk není nezbytná pro proliferaci buněk díky značné funkční redundanci, promiskuitě a výkonným kompenzačním mechanismům.
Konkrétní konfigurace molekul, které řídí průběh buněčného cyklu
u vyšších eukaryot jsou specifické podle buněčného typu; začínají být
také odhalovány nové nekanonické funkce cyklinů a Cdk.
. Cdk2 – nejmarkantnější příklad Cdk2 a jeho aktivátory cykliny E byly dlouho považovány za nepostradatelné regulátory savčího somatického buněčného cyklu.
2003 - Deplece Cdk2 (protismyslné oligonucleotidy, siRNA) má pouze zanedbatelný vliv
na proliferaci nádorových buněk kultivovaných in vitro.
(Tetsu and McCormick, Cancer Cell). 2003 – Myši deficientní v Cdk2 genu jsou plně životaschopné; s výjimkou poruchy ve
vývoji gamet nevykazují žádné známky vývojových abnormalit; tato skutečnost
naznačuje, že Cdk2 není nepostradatelná pro většinu, ne-li všechny somatické
buňky.
(Ortega et al., Nat. Genet.; Berthet et al., Curr. Biol.) CDK4 CDK6 cyklin D1 cyklin D3 Obecná otázka:
Molekulární mechanismy řídící vývoj žlutého tělíska
(potenciální cíle pro farmakologickou intervenci) Jedna specifická otázka:
Změny v množství proteinů regulujících buněčné dělení během vývoje tohoto orgánu Použitý biologický model – myš; Použitá technika – WB analýza Granulózní buňky Graafova folikulu těsně před ovulací Luteinizující
buňky Graafova folikulu 72 hodin po ovulaci Buňky žlutého tělíska ve třináctém dni gravidity Buňky žlutého tělíska v šestnáctém dni gravidity Buňky žlutého tělíska v osmnáctém dni gravidity Buňky zanikajícího žlutého tělíska 2 dny po porodu CDK2 p27 Analyzovaná stádia vývoje žlutého tělíska (1 až 6) Lýza buněk - získání proteinů Separace proteinů pomocí SDS-PAGE WB analýza pomocí protilátek Analyzované regulátory buněčného dělení Zpracování Výsledek Byly zjištěny změny v kvantitě šesti regulátorů buněčného dělení, k nimž dochází během vývoje žlutého tělíska u myši 1 2 3 4 5 6 Regulátory buněčného cyklu v reálném světě Prognostická hodnota exprese jednotlivých regulátorů
buněčného cyklu není zdaleka stanovena. p27 není dobrý prediktor výsledku léčby
karcinomu močového měchýře ! p27 – inhibitor CDK Je tento regulátor dobrý prediktor u nádoru močového měchýře? Co zejména bychom si měli pamatovat? funkce molekul regulujících buněčný cyklus ještě není
úplně pochopena
některé dnes obecně přijímané koncepty regulace
buněčného cyklu budou muset být revidovány
nové nečekané otázky musí být experimentálně ověřeny Děkuji za pozornost
Otázky a komentáře na:
ahampl@med.muni.cz