Přednáška

at a zastaví svůj cyklus v G1 fázi, je
p34/p36 defosforylován a nemá kinázovou aktivitu Kvasinky byly první: Obratlovci je mají také: 1987 – funkční komplementací mutace S. pombe cdc2 byl
identifikován lidský homolog kvasinkového genu cdc2
(Lee and Nurse, Nature) 1987 – v lidských buňkách byl identifikován p34 protein, který je homologní s p34cdc2 proteinem kvasinky S.pombe and p36CDC28 proteinem kvasinky S. cerevisiae
(Draetta et al., Cell) Lidský p34 protein byl imunoprecipitován z HeLa buněk označených [35S]methioninem s použitím monoklonální protilátky reagující s p34cdc2
a p34CDC28. Začíná se objevovat vztah mezi p34cdc2 and MPF: 1988 – MPF izolovaný (afinitní chromatografií s použitím p13suc1) z oocytů žáby sestává ze dvou hlavních komponent, proteinů o molekulových hmotnostech 34 kD a 42 kD; 34 kD protein je nejspíše homologem p34cdc2
(Dunphy et al., Cell, July 29) 1988 – MFP izolovaný z oocytů žáby obsahuje 32 kD protein, který je rozeznán protilátkou proti p34cdc2; 32 kD protein je asociován s 42 kD proteinem, s nímž tvoří komplex vykazující kinázovou
(Gautier et al., Cell, July 29) 1988 – histon H1 kinázová (H1K) aktivita, která je specifická pro M fázi, koeluuje při její izolaci s 34 kD proteinem, který je rozeznán protilátkou proti p34cdc2; MPF and H1K jsou nespíš stejnou entitou
(Arion et al., Cell) u buněk v G1 fázi je protein p34 defosforylován, není asociován s
proteinem p62 a nemá kinázovou aktivitu
všechny tyto parametry jsou revertovány u buněk v G2/M fázi
u buněk zastavených v M fázi působením nokodazolu se akumuluje
aktivní komplex p34/p62 1988 – lidský protein p34 (HeLa buňky) podléhá v závislosti na buněčném cyklu změnám ve fosforylaci a v uspořádání partnerů
(Draetta and Beach, Cell) Biochemie proteinu p34 naznačuje jeho úlohu v regulaci buněčného cyklu: 1983 – poprvé popsán jako protein, který podléhá opakované destrukci u rýhujících se vajíček mořské ježovky
(Evans et al., Cell)
1989 – syntéza cyklinu je nezbytná pro vstup do M fáze u oocytů žáby
(Minshull, Blow, and Hunt; Cell)
1989 – destrukce cyklinu je nezbytná pro výstup z mitózy u časných embryí žáby
(Murray, Solomon, and Kirschner; Nature) Cyklin vstupuje do hry: Příklad: fluktuace cyklinů A a B v časném embryu škeble minuty po fertilizaci cyklin A cyklin B Westendorf et al., J. Cell Biol., 1989 1990 – cykliny B1 and B2 jsou komponenty MPF oocytů žáby
(Gautier et al., Cell) imunoprecipitáty cyclinů B1 a B2 vykazují H1K aktivitu, která je
charakteristická pro MPF
exogenně přidané cykliny B1 a B2 jsou oba substráty této kinázové
aktivity
kinázová aktivita asociovaná s cykliny B1 a B2 osciluje s kinetikou, která
je stejná jako kinetika aktivity p34 kinázy „Kruh se uzavírá“: U vyšších eukaryot není situace tak jednoduchá: PARADIGMA
„buněčný cyklus jako cyklus cdc2“ atraktivní pro jeho jednoduchost další studie celou problematiku zkomplikovaly SE ZDÁL ALE 1991 – komplementací mutace CDC28 u kvasinky S. cerevisiae byla nalezena nová lidská p34 protein kináza (CDK2 – cell division kinase)
(Elledge, Spottswood, EMBO J.) CDK2 má 66% aminokyselinovou sekvenční identitu s CDC2Hs, která byla identifikována Lee and Nursem (1987) komplemetací cdc2 mutace u S. pombe NEJPRVE Velkému počtu existujících kináz příbuzných p34cdc2
(označovaných CDK – cyclin dependent kinases)

Velkému počtu existujících cyklinů

Skutečnosti, že různé cykliny interagují s různými CDK a
vice versa
Existenci dalších molekul, které interagují s komplexy
cyklin/CDK Enormní komplexnost molekulární mašinerie, která reguluje
buněčný cyklus, díky: Současný stav
(slovy) Současný stav
(graficky; zjednodušeno) Modifikováno z katalogu firmy Santa Cruz Biomedicals, USA Periodicita exprese cyklinů Detekce intracelulárních proteinů v kombinaci s detekcí DNA průtokovou cytometrií Významné fenomény Nekontrolovaná hyperproliferace A cesty k poznání jejich základů vztahujících se k regulaci průběhu buněčného cyklu Omezená proliferace Proliferativní choroby
(rakovina, psoriáza,
revmatická artritida, …) Neschopnost náhrady/obnovy
poškozených buněk/tkání Phenomen: Phenotyp: Profit: Nalezení biomarkerů
Design léčiv Indukce proliferace „kmenových buněk“ Pochopení molekulárních mechanismů regulujících buněčný cyklus je přeměňováno do disignu „chytrých“ diagnostických a terapeutických strategií. Jednoduchá logika pohledu na regulátory buněčného cyklu: Pozitivní Negativní Regulátory buněčného cyklu: Zástupci: CDK, cykliny Inhibitory CDK Snížená množství
& Inaktivovány Zvýšená množství
& Aktivovány Zvýšená množství
& Aktivovány Snížená množství
& Inaktivovány V hyperproliferujících
buňkách: V neproliferujících buňkách: Možné příčiny abnormální funkce regulátorů buněčného cyklu: Abnormality regulátoru
samotného Deregulace dráhy nadřazené
regulátoru buněčného cyklu Mutace v kódující sekvenci
Mutace v regulační sekvenci
(elementu)
Epigenetická změna v kódující
sekvenci
Epigenetická změna v regulační
sekvenci (elementu)
Abnormální posttranslační
modifikace
Jiné Příklad komplexnosti drah nadřazených
regulátorům buněčného cyklu Jak lze analyzovat abnormality regulátorů buněčného cyklu?
(srovnání normálních a abnormálních buněk) Na úrovni struktury genu: