BIOT2008-4 - přednáška

výšenou náchylností ke karcinomům kůže
navozeným expozicí UV-záření.
Geny udržující stabilitu
genomu
ÀDalší skupinou mutatorních genů jsou „mismatch“
opravné geny; kódované proteiny opravují chybné
zařazení baze při replikaci DNA. Projevem mutací
těchto genů je instabilita na nukleotidové úrovni –
mikrosatelitová instabilita. Zárodečné
mutace zejména MSH2 a MLH1 genů jsou
podkladem hereditárního nepolypózního
kolorektálního karcinomu (HNPCC) .
ÀMutace genů, jejichž produkty zajišťují „opravné
čtení“, jehož úkolem je identifikace chybných úseků
DNA při replikaci, byly prokázány u karcinomu
žaludku a tlustého střeva. Jedná se především o
mutaci genu pro polymerasu d.
Geny udržující stabilitu
genomu
À
Rozpoznání poškozené DNA a aktivace p53
vyžaduje přítomnost ATK. Tento gen kóduje kinasu,
která aktivuje jak CHK2 („checkpoint“ kinázu), tak
p53 při poškození DNA. Děti trpící ataxií-
teleangiektazií mají inaktivující mutaci obou alel.
ÀV klinickém obraze je pak imunodeficience,
mozečkové příznaky a zvýšené riziko vzniku
maligního nádorového onemocnění, především
lymfomů. Buňky těchto pacientů nemohou aktivovat
p53 jako odpověď na poškození DNA.
Geny udržující stabilitu
genomu
À Jiný syndrom označovaný jako NBS (Nijmegen breakage syndrom) je
způsoben homozygotní inaktivací genu NBS (nibrin), který se podílí
přímo na opravách poškozené DNA (poškození obou vláken). Do
tohoto mechanismu rozpoznávajícího a opravujícího poškozenou
DNA vstupuje též gen BRCA1 (“breast cancer susceptibility gene“) .
Mutace v jedné alele zárodečných buněk nesoucích tento gen je
odpovědná asi za polovinu případů karcinomu mléčné lázy s
familiárním výskytem. Při účinku proteinu BRCA1 hraje důležitou
funkci jak ATM, tak CHK2, které umožňují jeho fosforylaci, když
dojde k poškození DNA. ATM také fosforyluje kofaktor BRCA1 -
CtIP, který reguluje transkripci genu BRCA1. Defekty DNA-
opravného mechanismu přispívají k akumulaci genetických defektů
(viz genová nestabilita navozená genem HNPCC = gen pro hereditární
nepolypózní kolorektální karcinom) a podporují progresi maligně
transformovaných buněk.
Modifikující geny
ÀJde o geny, jejichž mutace může ovlivnit vznik a
rozvoj nádorového procesu.
ÀJejich produkty mohou pozitivně nebo negativně
působit na průběh kancerogeneze, a to
s interindividuální nebo interfamiliární
variabilitou.
ÀNa jejich prozkoumání se teprve čeká; bude
umožněno nejnovějšími technikami molekulové
biologie v oblasti genomiky a proteomiky.
Apoptóza a tumorigeneze
ÀRůst nádorových buněk je podmíněn nejen
nekontrolovaným buněčným dělením, ale také snížením
jejich opotřebovatelnosti a naopak zvýšenou schopností
přežít.
ÀVětšina nádorových buněk, ne-li všechny, získala rezistenci
vůči mechanismům vedoucím k jejich programovanému
zániku – apoptóze.
ÀExistují experimentální důkazy, že narušení signalizace
apoptózy je obecným předpokladem existence a rozvoje
nádorových buněk. Velmi důležitou úlohu přitom má
pravděpodobně onkogenní potenciál faktoru rodiny Bcl2.
Apoptóza a tumorigeneze
À Bcl2 (B-cell lymphoma 2) gen byl původně objeven jako gen napojený na
imunoglobulinový lokus v průběhu chromosomové translokace u folikulárního
lymfomu.
À Přitom se též zjistilo, že jeho nadměrná exprese má spíše než na proliferaci vliv na
apoptózu, respektive na její narušení. Znamená to, že nascentní neoplastické buňky
získávají touto inhibicí programovaného zániku selekční výhodu. Mohou setrvávat
zahnízděny jako ložiska v hostitelské tkáni, zejména v místech, kam se nedostanou
cytokiny a kyslík. Tento únik před apoptózou je pak podpořen dalšími onkogenními
sebezáchovnými mechanismy, které vedou ke vzniku agresivnějších klonů; defektní
apoptóza též usnadňuje metastázování, protože buňky mohou ignorovat restrikční
signály přicházející z okolí a přežívat odděleně od extracelulární matrix. Mutace,
které favorizují rozvoj nádoru, odvracejí odpověď na cytotoxickou terapii a vznikají
tak refrakterní klony.
À Úloha Bcl2 (a jeho homologů – Bcl-xL a Bcl-w) v mechanismu inhibice apoptózy
spočívá pravděpodobně v ochranném účinku na integritu mitochondrií tím, že brání
výstupu cytochromu c do cytoplasmy, což znemožní aktivaci kaspasové kaskády.
Vliv apoptózy na přežití
nádorových buněk (pro-
a anti-apoptózové
faktory)
Nadměrná exprese Bcl-2
inhibuje zánik buněk
apoptózou.
Je to způsobeno vazbou Bcl-
2 proteinu na BAX-
protein, což zabrání jeho
homodimerizaci, která
podporuje apoptózu.
Nádory a „nesmrtelnost“
buněk
À Nádorová buňka se stává „nesmrtelnou“. Je to způsobeno zvýšenou
aktivitou enzymu telomerasy. Opakované dělení buněk je omezeno -
zkracováním telomer.
À Telomery jsou klíčovým stabilizačním faktorem terminální části
chromosomu a ukotvují je k nukleární matrix.
À Telomery mají opakující se sekvenci nukleotidů TTAGGG.
À Délka telomer se zmenšuje po mnohonásobných pasážích (1 buněčný
cyklus = zkrácení o 1 telomer) a dále v buněčných kulturách od
pacientů v pokročilém věku.
À Jejich obnovování je katalyzováno telomerasou; délka telomer
koreluje s obsahem telomeras. Z toho důvodu se předpokládá, že
úbytek DNA od konce chromosomů zkracováním telomer vede
k deleci nezbytných genů, což má za následek omezení života buněk.
Nádory a „nesmrtelnost“
buněk
Počet telomer slouží jako generační hodiny, které
odpočítávají jednotlivé cykly buněčného dělení a určují
tak životnost buněk a replikační potenciál. Nádorové
buňky mají replikační potenciál vysoký; umožňují jim
to nejméně dva mechanismy, kterými si udržují
dostatečný počet telomer, respektive jejich
obnovování. Nejběžnější (aktivita prokázána u 85-90%
nádorových buněk) je
mechanismus TERT („telomerase reverse transcriptase“)
tzv. alternativní prodlužování telomer („alternative
lengthening of telomere (ALT) pathway“), které
umožňuje udržování počtu telomer bez vlivu
telomerázy

Význam angiogeneze v rozvoji
nádorového onemocnění
ÀAngiogeneze má klíčový význam pro růst nádoru.
Rostoucí nádorové ložisko může bez cévního
zásobení dosáhnout velikosti pouze 1 – 2 mm
3
, kdy
přívod kyslíku a živin je možný ještě difuzí z okolní
tkáně. Nádor pro další růst potřebuje vlastní cévní
zásobení. Popud je tomu dán vzniklou hypoxií
nádorových buněk. Ta navodí genetickou nestálost,
dochází ke vzniku mutací; mutace genu p53, který je
ochráncem genomu, neumožní opravu chyby
vzáměně bazí.
Význam angiogeneze v rozvoji
nádorového onemocnění
ÀDochází dále k nerovnováze mezi antiangiogenními a
proangiogenními faktory. Tato změna, kterou se
zahájí proces nádorové angiogeneze, se nazývá
„angiogenní switch“.
ÀObjevuje se nový fenotyp nádorových buněk,
vyznačující se potlačením antiangiogenních faktorů
– thrombospondinu – a zvýšenou tvorbou
angiogenních působků.
ÀBuňky nádoru a sousední endoteliální buňky se
v tomto směru vzájemně ovlivňují parakrinní, ale i
autokrinní sekrecí angiogenetických faktorů
Vzájemné ovlivnění nádorových buněk a endotélií při angiogenezi
VEDF=vaskulární endotelový růstový faktor; EGF=epidermální růstový
faktor; PDGF=růstový faktor odvozený od destiček; bFGF= fibroblastový
růstový faktor bazický; HGF=hepatální růstový faktor; MMP=matrixové
metaloproteinasy; IL-6=interleukin 6; IL-8=interleukin 8
Tumorová neovaskularizace
À Novotvorbu cév v nádorovém ložisku předchází
À vazodilace cév v nejbližším okolí navozená především
zvýšenou aktivitou NO-syntasy a tím produkcí NO-
radikálu. Ten také potencuje mitogenní účinek VEGF.
À produkce metaloproteinas rozrušuje bazální membránu,
čímž se usnadňuje nejen migrace endotelových buněk po
vláknech tvořených stimulovanými fibroblasty, ale i
migrace tumorových buněk.
À migrující endotelie jsou zdrojem integrinů zajišťujících
jejich životnost.
À Kapilární morfogenezi podporují ještě další působky –
(např. E-selektin). Vaskularizace nádorového ložiska
umožní jeho prokrvení (perfuzi), a tím jeho další růst.
Tumorová neovaskularizace
¾ Čím je angiogeneze intenzivnější, tím je prognóza nádorového
onemocnění nepříznivější; zvyšuje se riziko metastáz.
¾ Stupeň angiogeneze může sloužit jako prognostický faktor.
¾ Nejintenzivnější angiogeneze bývá na okraji nádorového
ložiska, kde lze její intenzitu posoudit histologicky. Používá se
také zviditelnění tzv. horkých ložisek (hot spots) pomocí
monoklonálních protilátek proti cévním endoteliím nebo proti
adhezním molekulám (CD31, CD34), event. proti von
Willebrandovu faktoru.
¾ Citlivým ukazatelem hustoty kapilárního řečiště je stanovení
akvaporinu-1 (AqP-1); jde o faktor působící synergicky
s VEGF a významně zvyšující cévní propustnost.

Molekulární patologie-metodologie
Kapilární sekvenace
Molekulární patologie-metodologie
Q-PCR (real time PCR)
Molekulární patologie-metodologie
Fluorescentní hybridizace in situ
Molekulární patologie-metodologie
Fluorescence in situ
À Barevné sondy, které jsou schopny identifikovat celý chromosom navázáním na
sekvence na povrchu (např. chromosomu 17) a tak nabarvit chromosom vybranou
fluorescenční barvou (Obrázek 5a)
À Centromerické sondy, které identifikují centromerickou oblast specifického
chromosomu a umožňují tak spočítat počet kopií tohoto chromosomu dokonce i v
interfázi nedělících se buněk (Obrázek 5b)
À Alelicky specifické sondy, které adherují na specifickou sekvenci cílové alely, jako
např. p53 nebo onkogenu HER2/neu (Obr. 5b)
À Normální buňka by měla mít 2 kopie onkogenu HER2/neu, 1 na každém
chromosomu 17. Použitím centromerické sondy pro chromosom 17 (zelená) v
kombinaci s alelicky specifickou sondou pro HER2/neu oncogen (oranžová) se dá
očekávat vizualizace 2 zelených a dvou oranžových signálů v každé buňce (Obr.
5b). V buňkách karcinomu prsu, ve které dochází k amplifikaci tohoto onkogenu, se
v jádře vizualizuje 4 a více oranžových signálů a pouze 2 zelené.
À Podobně kombinace 2 alelicky specifických sond na zlomovou oblast na dlouhém
raménku chromosomu 9 (zelený signál) a 22 (červený signál) je schopna detekovat
t(9;22) Philadelphský chromosom (Obr. 5c).
Spectral karyotype imaging
Molekulární patologie-metodologie
Spectral karyotype imaging (SKI)
(a) Displayové barvy
(b) Klasifikační barvy
(c) Konečný karyotyp se všemi 23 chromosomovými sadami v numerickém
pořadí
Molekulární patologie-metodologie
Spectral karyotype imaging:
(a) Translokation (1;11)
(b) Komplexní markerové chromosomy u karcinomu prsu
Molekulární patologie-metodologie
DNA microarray.
Každý čtvereček na
skleněném sklíčku obsahuje
1200 cDNA loci pro celkem
4800 genů.
(a) DNA microarray reader ukazuje fluorescenční intenzity různých cDNA. V
tomto případě gen indikovaný žlutě zjevně zvýšeně exprimován oproti
„modrým“ genům
(b) Rozdíly v expresi genů mohou pomoci identifikovat „vzorce“ k predikci
prognózy nebo terapie. Červeně označená skupina indikuje funkční cestu.