1. přednáška

DNA DIAGNOSTIKA
1869 – Mischer - objev nukleových kyselin – jádro + histony = baz. bílkoviny
spermie obsah protaminy – ne histony!!
1903 – hypotéza každý rodič půl genů
1905 – Stevens (♀), Wilson (♂) objev pohl. chromozomů
1909 – Garrod – metabol. poruchy = vrozené vady metabolismu = nepřítomnost enzymů (jeden gen = jeden enzym)
1910-15 – Morgan – cross.-over
1912 – lineární usp. genů na chromozomech – „korálky“
cross.-over uvnitř genů = korálky
1926 - Muller, Stadler – rontgen. paprsky = mutace
konec 90. let – objev RNA – jádro, cytoplazma
DNA: deoxyriboza x RNA: riboza - 2 pirimidiny, 2 puriny
nukleotidy spojeny pomocí fosfát. sk.
1953 – Watson, Crick – struktura DNA
1958 – objev DNA polymerázy
1960 – objev RNA polym. + mRNA
1966 – rozluštěn gen. kód
kodon = 3 nukleotidy, mnohé AMK = více kodonů (degenerace gen.k.?)
64 kombinací 3 bazí = 61 spec. AMK
UAA, UAG, UGA = terminační kodony
1967 – objevena DNA ligáza
1970 – restriktáza
1972 – ligáza = spojení fragmentů po restriktáze
1973 – naklonování DNA Ecoli
1977 – metody sekvenování DNA
1983 – Karry Mullis = koncepce PCR (1993-Nobel. cena za chemii)
1985 – 1. publikace užití PCR
PCR: detekce polymorfismů
rychlé množení vybraných úseků DNA in vitro
exponenciální růst
do té doby klonování DNA v mikroorganismech
bodový polymorfismus = SNP = single nukleotide polymorphism
1990 – projekt „Lidský genom“ = HUGO – asi 3,2 miliardy nukleotidů
čl. = asi 23 000 genů
HUPO = lidský proteom (= soubor , které jsou produkované z daného organismu) - teď hl. Alzheimer
rozdíl jednotlivců – 11 milionů SNPs + další typy polymorfních míst – inzerce, delece, repetitiv. sekvence
repet. selvence DNA – minisatelity = opak. 12-500 bp (VNTR = variable number of tandem repeats)
- mikrosatelity = 1-11 bp (STR = short tandem rep.)
lidský genom – cca 80 tis. dinukleotid. repet sekvencí
cca 60 tis. trinukl. repet. sekvencí (Huntingtonova chorea – CAG)
DNA polymorfismy = vliv na fci genů – rovnováha fyziolog. regulací = tzv. funkční polymorfismy – vliv na enzym. aktivity, strukturu a produkci proteinů, … = patogeneze někt. chorob
DNA diagnostika:
zdravotnictví:
detekce mikroorg. v klin. materiálu – sérum = ze srážl. krve (po centrifugaci)
plazma – odběr krve do zkumavky s EDTA, heparinem… - centrifugace, obsah. proteiny na srážení
stěry (oči, uretra, krk..), stolice, tkáně
diagnostika děd. nemocí
kriminalistika – identif. osob, otcovství, …
potravinářství – identif. bakterií, GMO potravin, druhů masa, mléka..
veterinární medicína – DNA detekce mikroorg. v klin, materiálu
- určování pohlaví živočichů, druhů
jiný obor a výzkum – identif. mikroorg. v pitné/balené vodě
- analýza archeolog. kosterních pozůstatků
- identif. rostlin. nemocí v zemědělství
přístroje pro analýzu DNA: termocykléry, RealTime systémy, sekvenátory I. a II. generace, čtečky DNA čipů


DNA
2 vlákna – H-můstky: C ≡ G, A = T + cukrfosfátová kostra na vnější straně
eukaryota + kvasinky! = lineární
ssDNA – polarita – orientace naproti sobě (antiparalelně) – v databázi vždy 5´ k 3´ !!
3´ _______ 5´
fosfát. sk. 5´ _______ 3´ OH sk.
čl. = 3,2 miliard bp
záporně nabitá
replikace DNA:
dvousměrná, semikonzervativní = v nových b. ˝ pův. + ˝ nová
začátek v replikačních počátcích
zničení DNA = silná kys. (HCl zhydrolizuje na malé podjednotky), UV (ne přímo degradace – různé spárování řetězců napevno – dekontamonace, ale ne malé kousky), chloraminy (savo)
DNA velmi stabilní – oddělení při 94 şC
repl. aparát:
iniciační proteiny → repl. vidlička
primáza – syntéza RNA primerů
helikáza – rozvíjení DNA šroubovice
nukleáza – odstranění primeru
ligáza – spojení fragmentů
svírací protein – udržení DNA polym. na vlákně
SSB proteiny (single-strand binding proteins) – udržení ssDNA
polymeráza – syntéza nového řetězce
oddělení: za fyziolog. podmínek - iniciační proteiny = přerušení H-můstků a navázání na repl. počátky (bohaté na A=T – slabší než GC
- bakteriální genom – 1 repl. poč. – kruhová DNA = repl. na obě strany
- čl. – 10-100 tis. (replikon = úsek DNA, který je zdvojen v rámci jednoho cyklu replikace DNA, řízen jedním počátkem replikace, v jaderné DNA eukaryotické buňky je r. chromatinová doména)
částečné rozpletení dsDNA – tzv. replikační vidlička – 1000 nukleotidů/s bakterie, 100 n/s čl. (pohybuje se DNA, proteiny pevně v jádře)
DNA polym.:
připojuje nukleotidy na 3´konec syntetizovaného řetězce → fosfodiesterová vazba mezi OH sk. a fosfát. sk. nukleotidu
= syntetizuje nové vlákno od 5´ k 3´ synt. řetězce = vedoucí řetězec
opožďující se ř. – Okazaki
nukleotidy do reakce = nukleotidtrifosfáty bohaté na E = E pro polym. reakci
přidává nový nukleotid pouze k dvouvláknu (nedokáže sama o sobě nové vlákno k ssDNA)
korektura – opravná fce DNA = odštípnutí + nahrazení
1 chyba/10 mil. bp
při syntéze od 3´ - nemožná oprava – odštípnutí → vznik 5´ = nelze prodl.
opožďující se vlákno:
Okazakiho fragmenty = kousky 5´→ 3´
templát pro DNA jsou krátké sekvence RNA (primery) = kpmplement. k DNA vláknu – syntetiz. primázou
diskontinuální syntéza – stále nové primery
RNA odštěpena nukleázou → dosyntetiz. DNA polym.
DNA ligáza pospojuje fragmenty
Ecoli:
repl. počátek = tzv. sekvence OriC → navázání proteinu DnaA (E v ATP)
hydrolýza ATP →odděl. řetězců – ssDNA cca 50 bazí = otevřený komplex
protein DnaB – fce helikázy – přepraven DnaC k DnaA → sevře ssDNA vytvořenou mezi DnaA a OriC
DnaA se uvolní → navázání gyrázy (spotřeba ATP) = mění sek. strukturu DNA (nezbytné pro replikaci) → DnaB odděluje
na ssDNA připojení SSB = brání annealingu (renaturaci)
primáza → primery → nasednutí polym.
polym. 1 – fce nukleázy – odstraní primery + dosyntetiz. fragmenty místo RNA
ligáza spojí kousky
transkripce DNA → RNA (A,U,G,C + riboza)
RNA – může tvořit prostorové struktury (i ds) – vzniká v b. transkripcí
RNA polym. – přepis DNA do RNA 5´ - 3´, nemá opravnou fci – 1 chyba/10 tis. b.
transkripce genu o vel. 1500 bp jednou RNA pol. trvá asi 50s (na úsek možno navázání až 15 polym. – 1 hod = z 1 genu až 1000 mRNA
1 mRNA = může sloužit najednou více ribozomům = polyribozom = translace
mtDNA – mitochondriální – mateřská příbuznost
jaderná – Y – otcovská příbuznost
mRNA – prim. struktura proteinu
rRNA – ribozomy
tRNA – adaptor = umístění AMK do správného místa na ribozomu → začlenění do AMK řetězce
snRNA – jaderná RNA
eukaryota: mRNA jad. póry do ER (= proteiny ven z b.) / rib. cytoplazmy (proteiny pro potřebu b.)
hnRNA (heterogenní RNA) – vznik při transkripci (exony + introny) → posttranskripční úpravy:
přidání čepičky na 5´ konec = RNA capping = atypický nukleotid G s methyl. sk.
polyadenylace – k 3´ přidán polyA konec ( i několik set nukleotidů)
→ stabilizace RNA + pomoc při transportu na rib.
vystřižení intronů z prim. sekvence RNA → mRNA
- sestřih několika způs. = alternativní sestřih – jiné sekvence mRNA v různých tkáních (v různých orgánech jiné proteiny)
RNA v b. degradována (po 30 min – 10 hod)
RNA polym. váže obl. kolem -32 až -10 nukl. start kodonu → uzavřený komplex
otevřený komplex vznik rozevřením DNA mezi nukleotidy –12 až +2
iniciace syntézy – katalyt. č. – RNA polym. se oddělí
na RNA dl. 70 a více nukleotidů se váže Rho protein (Ecoli) → umožní uvolnění uvolnění RNA z RNA polym.
translace mRNA→ prim. struktura proteinu
sekvence RNA čtena po tripletech (kodonech) = 1 AMK
gen. kod = přenos informace z DNA → protein
RNA překlad – 3 čtecí rámce
_________________________________
tRNA – antikodon komplementární ke kodonu mRNA
začátek = iniciační kodon AUG
21 AMK, 61 smysluplných kodonů, 31 tRNA molekul
na rib → polyrib.
DNA – stabilní: zničitelná kyselou hydrolýzou (1M HCl), nezničitelná autoklávováním
- A-DNA = pravotočivá, hustší – ve sporulujících bakteriích
RNA – labilní: podléhá slabé alkalické hydrolýze
- 1 – řetězcová , kr. úseky párování mezi sebou → různé = struktury
DATABÁZOVÉ ZDROJE
orion.sci.muni.cz/kgmb/bioinformat/ = info zdroje pro molek. biologii
NCBI (amer. databáze) – neplacené, nekontrolované sekvence
„pubmed“ - nucleotide (sekvence genů, pokud znám název)
genome (celý)
taxonomy – dle druhu (lat. název, nevím, zde je osekvenován genom atd.)
též proteinové sekvence
netranslatované (netranskribované) obl. (začátek, konec)
„červené čtverečky“ = exony, mezi = introny
sekvence mRNA bez intronů
2 formáty → fasta: jen sekvence (pracují s tím další programy) + hlavička
→ genbank: detailní popis sekvence – accession number = databázový kód, od koho…., citace v časopisech, odkazy na články
genome DNA – s introny
CDS = coding sekvence = mRNA
„blast“ - hledám název k mé sekvenci → nucleotide – k DNA
znám své → co má ještě podobnou sekvenci?
fylogeneze: hledám „víceméně shodné“
jinak vysoce shodné – chci vědět, co přesně to je
taxonomy reports – kam to taxonomicky patří
i různé fylogenetické stromy
MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PŘED A PO PCR
PŘER PCR
známy restrikční endonukleázy = štěpí DNA ve specif. sekvenci 4-8 nukleotidů
→ tupý (rovně „uřízlé“)
→ lepivý konec (1 vlákno přečnívá) – po rozštěpení fragmentů spojení např. s jiným fragmentem ( i z jiné DNA) → spojení cukrfosfát. kostry
polymeráza: potřeba E – př. z trifosfátu (navázání na fosfát → odtrhne difosfát + E → vznik mezi O na jednom cukru a fosfátem na druhém
ligáza: místo trifosfátu bere E z ATP hydrolýzou
klonování: - v b. plazmidy (rezistence na antibiotika) = smostatná replikace v bakt.
rozštěpení plazmidu a DNA → vložení DNA části do plazmidu (lepivé konce = ligace) →na gel: rozpoznat, co má DNA část a co je znovuspojený plazmid → namnožení plazmidu s DNA
1977: Maxam-Gilbertova sekvenační metoda
chemická metoda – specif. chem. degradace purinových a pirimid. bazí
→ puriny modifikovány dimethylsulfoxidem (G,C)
→ pirimidiny pomocí hydrazinu (A,T)
→ následně pomocí 1M piperidinu při 90˚C štěpena cukrfosfát. kostra v místě příslušné modif. báze
méně modifikátoru a hodně DNA → náhodné štěpy
zisk fragmentu klonováním v plazmidu
označení vzorku z plazmidu radioaktivní značkou
→ štepení restr. enzymem
→ denaturace
→ 4 zkumavky: štěpení za C
za G rozhoduje t a koncentrace
za C + G
za T + A
→ gel – 4 dráhy: dle různé délky fragmentů odečet sekvencí
G A+G C+T T
G __ __
T __ __
A __ ↓ délka fragmentů
T __ __
C __
G __ __
= sekvenace nulté generace stovky bazí/den - cca do r 1991 (90)
první generace – enzymaticky – desetitisíce/den
třetí generace – miliardy/den


PCR
1983 – Karry Mullis
metodika:
návrh primerů na základě známé sekvence DNA
syntéza primerů
příprava mastermixu (dNTP, DNA polymeráza, primery, voda, pufr, DNA templát)
vložení do termocykléru
detekce PCR produktu
dvoukroková PCR – střídání jen annealingové a denaturační teploty
třeba:
termostabilní enzym → typy polymeráz Taq (The