1. přednáška

– velmi levná – nesedí s restriktasou v obl. SNP → mismatch primer = vytvoří požadovanou sekvenci (způs. záměnu v 1 b.) – SNP nesmí být na konci!
př: 300 lidí – 20 SNPs → 6000 PCR, restr. analýz a gel + vyhodnocení
RealTime PCR
specif. fluorescenční sondy:
→ hydrolizační – TaqMan:
během reakce se rozštípe na kousky
R a Q = 2 barvy → rozštěpení → fluorescence
→ hybridizační:
sonda nasedne, není rozštěpena a zase odsedne
3 cykly: denaturace, nasednutí sondy, extenze řetězce →odsednutí
FRET
- 2 fluorescenční barvy – blízko sebe = 1 sonda emituje záření a ozařuje druhou sondu → emitace = měřena = „fluoreskuje 1 sonda“
molecular beacon
hlavička – hledaná sekvence
krček – G a C - udržuje R a Q u sebe
hlavička přihybridizuje →100% shoda →roztržení krčku
neštěpena polym, zase odhybridizuje
pravidla pro návrh sond:
polymorfismus přibližně uprostřed sondy
Tt sondy o 10 ˚C vyšší než Tt primerů
nevytvářet žádné stabilní struktury v rámci sebe
Zvýšení stability duplexu sonda-DNA = modifikace bazí:
→ LNA sondy – vyměněna ribosa = vyšší specifita
→ MGB sondy – po nasednutí zesílí interakci = „zámek“ = vyšší Tt
2 různé barvy pro různé báze →svítí ˝ n. obě (heterozygot) →křivky
př: potřeba 6000 PCR – softwar analyzuje automaticky bez RFLP a gelu (destičky na max 96 n. 384 vzorků)
METODA SnaPshot
možno detekovat až 12 SNPs najednou/1 reakce
trvá 1 den
→ amplifikace oblastí
→ přečištění PCR produktu - odstranění nepoužitých primerů a nukleotidů
exonukleáza 1 = štěpí ssDNA = primery
alkalická fosfatáza = inaktivuje nukleotidy = odštěpí fosfát
= purifikovaný templát
SnaPshot primer = skončí přesně bázi před polymorfismem (12 primerů)
+ templát (12 smíchaných PCR produktů)
+ mix – ddNTPs = dideoxynukleotidy – každý označen jinou barvičkou
začlenění do řetězce = dál se neamplifikuje
za S. primer nasedne jeden ddNTP → analýza
primery o různé délce → separace dle délky = určení polymorfismu – barva = genotyp
polymorfismy 3-4 báze od sebe
př: 20-60 bp → 12/1 reakce – problém s reakcí primerů mezi sebou
METODA SNPlex
až 48 SNPs najednou
trvá 2 dny
cycler:
ASOA1 = Allele-specific oligo A1 - jeden nese C a jeden G
ASOA2
zipcode sequence – nese fluoresc. značku
LSO = locus specific oligo – sekcence za mým polymorfismem
universal reverse PCR printing site = univerzální sekvence
LSO linker
ASOL1
ASOL2
→ elementy nasednou na DNA
ASO s G LSO
ZIP CATTGTACGTTAGG
__________ACATGCAATGC_____________ genomová DNA
ASO – nesoucí C nepřisedne → ligáza nespojí
→ ligáza spojí ASO a LSO → denaturace – spojené elementy
ASO s C ↑ LSO
ZIP GACTGTACCTTAGG
__________ACATGCAATGC_____________ genomová DNA

→ ligáza nespojí → denaturace – elementy odsednou
do roztoku obě ASO, jen jedno nasedne plně komplementárně a je spojeno ligázou
→ PCR zligovaného produktu (díky univerz. F a R primerlm v roztoku)

F ________________________________ R
→ při nezligovaném materiálu neproběhne
F _________________
_______________ R
→ PCR produkt přichytit na destičku → sonda → denaturace = sonda se oddělí – délka (na kapilárním sekvenátoru) a barva = ???
→ specif. hybridizační sonda – k 1. a 2. ZIP kódu → jaká značka se namnožila → jaký polym.
není 48 fl.barev (ZIP): ZIP sekvence různě dlouhé (jako SnaPshot) = 48 různých délek s různými barvami
př: zlevnění. desítky korun/SNP
DETEKCE SNPs POMOCÍ METODY GOLDENGATE
genotypizace vybraných SNPs
formát matrice n. čipu (Illumina, Afimatrix)
16 n. 96 vzorků najednou
96-1536 SNPs/vzorek
prům. call rate > 99% = míra odezvy = kolik SNPs určitě zanalyzuje (1521 z 1536)
Illumina:
čip – tzv. kuličky
povrch = vyleptané díry (fotolitograficky) → 3 mikrom. kuličky v jamkách
→ každá kulička = 1 optické vlákno v matrici = odečtení fluorescence an každé kuličce
_________________________
na každé kuličce přisyntetizovaná sekvence
eppendorfka – směs kuliček se sekvencemi →vylití na sklíčko →zapadnutí do jamek
= statistická směs = v matrici přibližně stejný počet od každé sekv.
v jamce drží díky hydrofobním reakcím
DNA aktivace = nabiothinilování (= vaření s biothinem)
→ ASO 1 + LSO 1 ligace/ne
→ ASO 2 + LSO 2
→ značka = adress
→ univerzální primery – P1, P2 = 2 barvy a P3 bez barvy → č=A/z=G/č+z =A/G= jaká báze na konci = jaký SNP = 3 primery pro všechny SNPs

= smíchání → přihybridizování: zahřátí směsi na 70˚C a pomalé ochlazování na 30˚C = přisednou postupně specif. oligonukleotidy
→ ligáza → vytažení zlig. produktů → amplifikace primery → přihybridiz. na kuličky →skener = dle adresy pozná jaký polym. a dle barvy jestli G/C (A/T) – analyz. jen 2 možnosti
k čipu dostanu ještě CD s daty, kde na jaké kuličce je jaká sekvence: př. kulička 2 = CTGAC = SNP č. 4
každý SNP na čipu nanesen 30x →softwar udělá průměr…není 100% úspěšnost
na destičce oblasti: různí lidé n. jednotlivé tyčinky=1 čl. →nanesu vzorky
př. SNP č. 4 - 90 lidí – u některých svítí č/z/obojí - tečka mimo = nezanalyzován = call rate
č.
____________________________________ z.
Affymetrix:
resekvenuje – třeba vědět, jak sekvence přibližně vypadá – nelze sekvence de novo (př. rozdílné genomy čl)
čipy: skleněná deska – přímo na ní nasyntetiz. řetězce (fotolitografie)
= na pevný povrch max. 30 bp dl. ř. x kulička – klidně 100 bp
= ř. nemají víc než 25 bp.
NA naštěpím restr. endonukl. – Nsp/Sty → lepivé konce různé → adaptér na Nsp/Sty
1 primer: F=R (dané adaptérem) = one primer amplification
→ zmnožení štěpů
→ fragmentace → označení 1 fl. značkou
→ hybridiz.na destičku = na ní sekvence s různými bazemi komplementárními k nanášenému SNP = rozlišuje hybridizace
→ vznik duplexu = sonda na čipu svítí → dle pozice na čipu poznám zda T/A/heterozygot
SNP musí být přibližně uprostřed sondy na čipu
problém: na někt. obl nelze navrhnout oligonukleotid - př. na G/C bohaté/chudé
→ velké klastry (rozptyl) = horší analýza
- detekce 4 mil. SNPs
AIDS
= aquired immunodeficiency syndrome = syndrom získaného selhání imunity
virus HIV: = human immunodeficiency virus
pokles bílých krvinek → oportunní infekce = AIDS
napadají množství tkáně – hl. CD4 helprové lymfocyty – třeba CD4 receptory (i v nerv. tkáni) → nedostatek helpr. b. → imunodeficit → oportunní inf. → smrt
začlení se do genomu b.
přenos: pohl. styk, krev, tělesné tekutiny (i v slzách = malá konc.)
HIV 1 = celý svět – silnější a rychle se vyvíjející
HIV 2 = méně agresivní, hl. Z Afr.
léčba: souvisí s rezistencí vůči HIV – známo 7 faktorů (=polymorfismů) = brání nákaza, příp. rozšíření viru → transplantace k. dřeně s rezistencí = čl. stále nakažen, ale bílé krvinky rezistentní
→ SDF-1, HLA*Bw4 (homozygoti),. polym. 64 I genu pro CCR-Z, polym. G403A a C28G genu pro RANTES, polym. delta 32 genu pro CCR5 (rez. urč. způsobem)
poprvé objeven v 80. letech v USA u homosexuálů
1980-81 = první oficiální případy AIDS
roste exponenciální řadou – asi 16 tis. nakaženách/den
2/3 nakažených v Afr.
původ:
skoková mutace opičího viru SIV a přenos krví na čl.
přenos z opice na čl. prostřednictvím očk. látky vyráběné z opičí krve (= proti vir. hep. B - 1978 NY očkování gayů →1980 20% symptomy AIDS)
epidemiologie: Afr. – heterosex. styk, matka →dítě
rozvinuté země – časté střídání partnerů, injekční užívání drog
biologie:
HIV 1 = obalený RNA virus - podtř. Retroviridae
genom HIV nestabilní = stále se mění (již nakažený se může nakazit jinou mutací)
ssRNA
genom kóduje množství proteinů nezbytných pro replikaci
gen pol kóduje reverzní transkriptázu = po průniku do b. přemění RNA → DNA → zabudování do DNA b.
3 fáze infekce:
serokonverzní – počátek tvoření protilátek – detekovatelné v séru
→ trvá 6-8 týdnů po infekci
→ 75-80% pacientů teploty
→ 60% vyrážka vypadající jako akné/makulární – větš, hrudník a záda (nebolestivé, nesvědí)
→ často léze an genitálu a v ústech – trvá 2-6 týdnů
asymptomatická latentní – množení → poškození imunit. systému
symptomatická – vývoj AIDS a rozvoj oportunní inf.

ke vstupu do b. třeba CD4 receptor a někt. koreceptor (CCR5, CXCR4, …. = chemokinové recep. sloužící ke komunikaci mezi lymfocyty)
diagnostika:
senzitivita testu: A/ (A+C) A= skutečně pozitivní
specifita: D/ (D+B) B = falešně pozitivní
C = falešně negativní
D = skutečně negativní
př.: A= 500, B= 3, C= 1, D= 10000
senzitivita: 500/ (500+1) = 99,8%
specifita: 1000/ (1000+3) = 99,7%
→ zkouška ověřeným kitem: 501 pozit.(A+C), 1003 negat. (B+D)
→ vaším kitem z 501 → 1 f. negat, (C)
z 1003 → 3 f. pozit. (B)
1985 – první HIV test na bázi EIA testu
EIA (ELISA) metody
detekce protilátek
detekce antigenu p24 (přimo viru)
- dnes i kity na obojí dohromady = cca 3 týdny
konfirmační testy – Western blot, IFA
(kity spíše nastaveny na pozit. co nejsou než opačně)
rychlé testy
DNA diagnostika (nejpřesnější – cca týden)
EIA – detekce protilátek
infekce HIV-1 → protilátky proti vir. proteinům (envelope, gp120, gp41, gp160,…)
protilátky v séru u větš. za 4-12 týdnů od nákazy, u všech za 6-12 měs.
nejprve IgM protilátky, asi o týden později IgG → konc. IgM postupně klesá během týdnů a IgG roste = vys. konc. IgG přetrvávají několik let
hladina protilátek v séru kolísá – i pod hladinu detekovatelnou EIA
nejpoužívanější metoda ve světě
negat. výsledek = ukončení
relativní v. = nové EIA testování
ČR: relat. → poslání do národní referenční laboratoře
1. pozit. výsledek = tzv. reaktivní → konfirmace pomocí Western blotu/imunofluorescence - pozit. = potvrzení HIV pozitivity
- neg. = vyloučení
kity EIA:
I.generace – lyzáty inf. lidských T buněk – často faleš. pozit.
II. a III. generace – rekonbinantní antigeny a syntetické peptidy
→ faleš. pozit. : po očkování proti chřipce, po někt. bakt. a kvasink. inf.
→ faleš. neg.: časté testování, genet. diverzita viru, imunosupresorní terapie, velmi pozdě
IV. generace – detekuje protilátky i p24 = zvýšení senzitivity testů, zkrácení doby záchytu ze 4-6 týdnů na cca 3 týdny po nákaze
konfirmační testy:
detekce specif. protilátek
technicky náročné a drahé
s EIA společně specifita 100%
senzitivita = I. a II, gen, EIA testy
rychlé testy:
princip: aglutinace
imunoblot
imunofiltrace
imunochromatografie - nejčastěji používané – př. těhotenské testy
→ diagnostický proužek
→ kontrolní a testovací obl. – kontrolní a testovací linie
→ poduška pro vzorek – protilátky nesou Ag kousky, latex? → putují k „zachycovadlu“ → proužek
hl. místa se špatně dostupným labor. zázemím (rozvoj. země)
test uživatelů drog a prostituujicích
anonymní testování
přednosti: rychlé výsledky (1-20 min.), snížení finanč. nákladů, nepotřeba labor. zařízení
DNA diagnostika:
přímý záchyt RNA/DNA →její kvantifikace n. genotypizace
vysoká senzitivita – možnost záchytu po několika dnech od nákazy – senz. a specifita 100% za přísně kontrol. podmínek
vysoká cena (1800 Kč/test)
přímý záchyt DNA v plné nesrážlivé krvi n. bílých krvinkách
záchyt RNA ze séra/plazmy s následnou RT na cDNA
kit AMPLICOR HIV-1 (Roche Molecular Diagnostics)
kit AMPLICOR HIV-1 MONITOR 1.0 = kvantifikace vir. RNA (určené vir. zátěže)