1. přednáška

rmus aquaticus), Pfu (Pyrococcus furiosus) = termofilní organismy x netermost. = >60˚C rozklad = po každém kroku se znovu přidával enzym
templátová DNA - třeba znát sekvenci
staveb. jednotky dNTP mix – deoxyribonukleotidtrifosfáty A, T, G, C
DNA syntetizátory → primery = syntetické oligonukleotidy ke 3´ koncům templátu
- dodávají se lyofilizované (vysušení mrazem) – v cykléru a s pomocí vakua (= ochlazení) → v labu přidání vody – potřebná koncentrace
termocyklér – mení v kr. době t termobloku
DNA polym. (pro fci třeba Mg), templát, primery, dNTP, pufr s MgCl2, voda → termocyklér
design primerů:
od 5´ k 3´
čl: délka 18-30 bp → pravděpodobné nalezení 2 stejných míst o délce 20 bp = 9.10-26
nesmí obsah. sek. vnitřní struktury
obsah G/C 40-60% (méně = špatně se vážou a drží, více = špatné oddělení při denaturaci)
vyrovnaná distribuce G/C proti A/T segmentům (špatně: CCGCCGCGCATAAAT)
nekomplementární sám sobě ani druhém primeru
t tání 55-65˚C
optimální annealingová t vždy o 5-10˚C vyšší než t tání primerů
pr. by měly mít shodnou t tání
5´ __________________________________________ 3´
3´ __________________________________________ 5´
→ posílá se vždy sekvence napsaná 5´- 3´
postup:
denaturace – cca 94˚C 1 min
annealing – cca 65˚C (forward + reverse primer) 25-45x
extenze – cca 72˚C (optimum pro polym. – only dNTPs)
pokaždé přístroj počká 30s = vyrovnání t vzorku s termoblokem
možno i v 1 mikrolitru = zvl. termocyklér (v kapičkách = kryto hmotou = zabrání vypařování) = moc málo vzorku
alelově specif. primery = fce jen pokud alela přítomná
polym. syntetizuje tak dlouho, jak nastaveno na přístroji
2n kopií/cyklů
termocyklér:
amplifikátor – mění t termobloku v kr. časových intervalech 4 - 100˚C
→ programace: jak dlouho, přo jaké t, kolik cyklů, jak rychle chladit (někt. neumožňují rychlé chlazení)….

chlazené vodou – pomalé chlazení
piezoelektrické články (články dost rychle odchází – třeba měnit termoblok!)
temperované vzduchem – mnohem přesnější a rychlejší (DNA se váže na sklo – třeba něco navíc v pufru = obalí skelněnou kapiláru, kt. se dává se vzorkem do přístroje)
5´ ____________________________________ 3´
3´_____________________________________ 5´

5´ ____________________________________ 3´
3´_____________________________________ 5´
úsek ohraničený primery na každém vláknu → sekvence, kt. chci = zvětšuje se pouze kr. sekvence + tenplát 1x + sekvence z 1. cyklu s primery jen z jedné strany
čím více G/C tím větší annealingová t (3 můstky)
T/A nižší
Nested PCR
2 páry primerů – 2 vnitřní + 2 vnější
detekce i 1-10 molekul DNA x normální nejméně 100 molek.
dvoukroková: 2 zkumavky (protože polym. nenaamplifikuje méně než 100 molekul)
___________________________________________________________
___________________________________________________________

→ 35x ve zkumavce = předamplifikace
→amplifikát do 2. zkumavky + vnitřní primery = zviditelnění = další namnožení
jednokroková: vnější primery sedají při vyšší anneal. t
25x 98˚C, 68˚C, 72˚C → 25x 94˚C, 55˚C, 72˚C
třeba málo vnějších = aby se při prvních cyklech vyčerpali – aby nenasedaly ještě s vnitřními
hot start polymeráza = aktivní až po uvaření (=cca 10 min 94˚C) → nefunguje už při pokojové t ve zkumavce x normální

analýza PCR produktu: ___________
gelová elektroforéza (agarosa) DNA záp. nabitá +
polyakrylamidová elektroforéza ↑
restrikční analýza = RFLP - ___________
čl.= všechny chromozomy x = homozygot/heterozygot = různé délky fragmentů

RealTime PCR
PCR v reálném čase (bez další detekce (=elektroforézy, atd.) – geometrické znázornění)
vysoká přesnost, specifita, senzitivita (srovnatelné s Nested PCR)
alelická diskriminace (specifická detekce alel – bodových polymorfismů) → je polym.? a jaký?
kvantifikace (relativní x absolutní)
plus/minus metoda (je/není cílová sekvence)
objevil R. Higuchi et al. (1993)
průběžné využití UV a EtBr (etidiumbromid = karcinogenní látka, váže se specif. na proteiny DNA → svítí) = použití na barvení agaroz. gelů → proužky viditelné (mohl pozorovat přibývání produktu v reálném čase)
→ snímáno CCD kamerou
SybrGreen – váže se nespecif. na jakoukoli DNA = barvení DNA → primery mohou sedat na cokoliv = omezené použití – v klinické diagnostice nepřípustné! (SG označí vše) → využití především při kvantifikaci mRNA
pasivní referenční kontrola – barva ROX (firma ABI? – applied biosystems) = svítí ve spektrech nepřekrývajících se s detekcí → softwar při chybě objemu (1.vzorek = 11 mikrol, 2. = 10 mikrol,,…) = zjistí množství barvičky a dopočítá na průměr z více vzorků (upraví pozadí na kvantifikaci)
senzitivita = kolik cílových molekul možno amplifikovat (Nested x normál. PCR)
specifita = váží se všechny vazby primeru
TaqMan proby (taqmanovské sondy)
specifické
vazba z amplikonu = další rozměr specifity (= dána primery + sondou = srovnatelné s Nested)
oligonukleotid – fluorescenční značky
→ 1 konec = reporter: po ozáření světlem o urč. λ vydává světlo o jiné λ – VIC, FAM (6-karboxyfluoresclin)
→ 2 konec = quencher („zhášeč“): fluorescenční (TAMRA = 6-karboxytetramethylrhodamin) /nefluor. (ECLIPSE)
hybridizuje s amplikonem
na 3´ konci blokace proti prodlužování řetězce polym.
kr. vzdálenost R a Q → fluorescence emitovaná R potlačována Försterovým rezonančním přenosem energie = po přidání do roztoku nesvítí
→ pokud se barvy vzdálí, dostanou do mastermixu = svítí!
TaqMAn: využití polym. s 5´ - 3´ exonulkelázovou aktivitou při syntéze, narazí na dsDNA před sebou = odštěpuje druhý řetězec a dál synt.
→ přisedlá próba štěpena polym. →R a Q do roztoku = svítí (specif. excitační spektra → vyvolá emisi = emisní spektra = u barviček specif.)
RealTime změří emisi po každém cyklu
RealTime termocykléry:
kamera a žárovka osvětkující vzorky světlem → PC (hodnotí míru fluorescence v každém cyklu a jamce)
světlo jde na kapiláru – měřeno odečtem na každé kapiláře zvlášť
cílová DNA se detekuje zprostředkovaně = přes próbu (R)
u delších úseků těžší a nepředvídatelná amplifikace = čím kratší, tím lepší
TaqMan alelická diskriminace:
detekce SNPs
záměna → nespecif. sednutí
2 různé sondy (př. VIC a FAM) → 1. sonda sedne při alele B, nesedne při záměně A, 2.. sedne při A a nesedne při záměně B
→ 1. sonda uprostřed C/G, 2. A/T = určení báze G/C?, A/T?
alela A alela B

_______________ _________________
________________ __________________ ( větší výdrž primeru)
→ odštěpování – lépe sedí = lepší amplifikace →lepší signál na PC → křivka ukáže míru ampl. (míru dobře připojených sond)
→ i odlišování homozygot/heterozygot
přístroj analyzuje při aspoň 40 vzorcích = metoda grupování (aspoň 2 lidi/1 sk.)
→ určí genotypy u jednotlivých vzorků
kvatifikace pomocí RealTime
užití v klinice – diagnostika odpovědí na léčbu (HIV, hepatitida B a C, herpetické viry (stěr z oční rohovky) = rezistence na léčbu
absolutní k.
kvantita vyjádřena přímo množstvím
třeba standardy, jejichž konc. absolutně známa
zadají se standardy – přístroj vztáhne kvantitu k urč. standardu (rozdíl 4 cykly je rozdíl V asi 10x = ředící řady → křivky)
relativní
srovnává kvantity bez absolutních číselných hodnot (vhodné pro výzkumné účely)
využívá endogenní kontroly (není vytvářena standardní křivka)
ΔCT = poměr koncentrace jednoho produktu k druhému – kons. hodnota
(pokud účinnost PCR v obou systémech stejná, pak je ΔCT kons.)
konverze ΔCT na poměr: produkt A/ produkt B = 2- ΔCT
př. ΔCT mezi pr. A a B = 5 cyklů (A vybíhá až po 5 cyklech po B = menší konc.) → 2-5 = 1/25 = 1/32 = produktu A je 1/32 pr. B
AGAROZOVÁ ELEKTROFORÉZA
ag. gel = nosič – přečištěná agaroza z mořs, řas, netoxická
→ separace DNA o délce 50/60 bp – desítky kilobazí
→ rozlišení +- 5 (10) bp
- většinou 0,5 – 3% - čím kratší fragmenty, tím hustší gel (ρ závisí na délce fr.) → 60-150 bazí = 2,5 – 3%
→ 150 – 1000 b. = 1,5 – 2%
DNA díky záp. nabité cukrfosfát. kostře putuje k anodě
délka fr. nepřímo úměrná doputované vzdálenosti
← kalibrační přímka
___________________ log délky
→ odečet délky není na bázi přesně (+- 3-5 b.)
delší fr. = pomalejší putování (gel = „polymerní mřížka“)
pH nutno mezi 8-9 (aby byla cukrfosf. kostra záp. nabitá) → TBE pufr (tris, kys. boritá, EDTA (zabraňuje práci nukleáz)) / TAE pufr (kys. octová, tris, EDTA)
(při přípravě se nemění pH = smíchání v daném poměru = pH=8 !!)
do vzorku nanášecí pufr = vizualizace + sednutí v jamce (vyšší ρ)
→ obsah často bromfenolová modř, 50% glycerol/ 20% sacharoza (= tíha), TBE/TAE
xylenová oranž = vizualizuace čela – putuje asi jako fr. při délce 50 bp
při cca 100V, 45 min. (200V, 15 min) (více voltů a déle → zahřátí přístroje a rozvaření gelu)
červená kabel +, černý –
vizualizace:
EtBr – fluoreskuje při interkalaci do DNA (v roztoku nefluoreskuje, gel ponořit do roztoku) - mutagen, karcinogen
často se dává do gelu již při přípravě
putuje ke katodě
separace 2-3 hod = vymigruje z gelu, vzorek poté méně svítí = lepší obarvit poté
zničení: UV světlo po dl. dobu → osvětlování gelu co nejméně – při rozkladu reaguje s DNA!!!
SybrGreen
polyakrylamidový gel – rozlišení přesně na bázi
hustotou gelu volím, jaké fr. budu separovat
zákl. složení: polyakrylamid, TEMED (síťovadlo), voda, TBE pufr (n. tris 1,5M a SDS)
jiná aparatura, nelití mezi 2 skla
většinou 5-20% (20% = 20-80 bp = nejkratší)
RESTIKČNÍ ANALÝZA
pomocí restr. endonukleáz – štěpí dsDNA ve specif. sekvenci 4-8 nukleotidů = třeba mít specif. sekvenci
→ zisk z bakterií (ničí DNA jiných bakterií)
stejně dl. řetězce DNA (př. po PCR) rozliší na základě odlišné délky restr. fragmentůa specif. endonukleázy
univerzální primery – př, pro rod - neamplifikují stejně = 2 druhy: restr. endonukl. různě rozštěpí - detekce patogenů, mikroorg, na druhy
někt endonukl.:
štěpí pouze methyl. DNA - DNA vyizolovaná z org. vždy methylovaná!!
neštěpí methyl. DNA - po PCR DNA nemethyl.
star activity – dojdou specif. fr. →štěpí kdekoliv = třeba štěpit kratší dobu (2,3) hod.) – neprovádět inkubaci přes noc
(firma prodávající restr. endonuklázy)
→ products → NEB cutter = program – znám sekvenci – nalezne enzymy, kt. tuto sekvenci štěpí (prodávané firmou)
→ emzyme finder: najde přímo enzym na urč. místo, co chci
METODY POUŽÍVANÉ K DETEKCI POLYMORFISMŮ
(středověk: trombofilní faktory = lepší přežití při vyšší srážlivosti krve →kumulace polym.)
bodové polym.:
bodové = SNP = single nucleotide polymorphism = jednobodový polym.
genom čl. = cca 10 milionů SNPs (=3 biliony bp)
možno využít DNA čipy
inzerčně-deleční = bodové i ne – většinou fatálnější = posun čtecího rámce (baze navíc/chybí)
nemožno použít DNA čipy
DETEKCE POMOCÍ PCR – mismatch primer
bodové : posled. baze na primeru:
kompatibilní → produkt
nekompatibilní → X
polym. často 5´- 3´ exonukl. aktivita = nejednoznačné výsledky
slabý fr. = sl. pruh → téměř se nepoužívá
perfektní sednutí = silný pruh
inzer.-deleční:
agaroz. gel = rozdíl nejméně 5 bazí x jinak polyakr. gel
2 a více lišících se bazí
5 a více – primery normální →různá délka
RESTRIKČNÍ ANALÝZA
bodové: homozygot: rozštěpený produkt
nerozštěpený produkt
heterozygot – 2 pruhy = rozštěp/nerozštěp.
endonukleasa Taq 1 (5´ - TCGA- 3´)