skripta

1 Mikroskopická technikaMikroskopPodobně jako v ostatních biologických disciplínách tak i v zoologii patří mikroskopování k základním metodám pedagogické i vědecké práce. Umožňuje pozorovat drobné objekty, které pouhým okem nevidíme vůbec nebo jen obtížně a nepřesně. Okem můžeme rozeznat jen předměty, jejichž zorný úhel je větší než půl minuty.Podle principu, na kterém je mikroskop založen, rozlišujeme dva základní typy mikroskopů: 1) optické: Chod paprsků je usměrňován skleněnými nebo křemennými čočkami. K vytvoření obrazu je využíváno světelných paprsků vlnové délky cca 1000 až 10 000 Angströmů.2) elektronové: Elektronové částice získané výbojem jsou usměrňovány elektromagnetickými cívkami, které nahrazují optické čočky. Elektronové vlnění má cca 100 000 x kratší vlnu než světelné.Mikroskop je složen z části 1. mechanické, 2. optické a 3. osvětlovací.1. Mechanická část mikroskopu je tvořena masivním kovovým stativem. Je složen z těžké podkovy, ke které je připojen stolek mikroskopu a nosič tubusu. Na nosiči je pohyblivě upevněn tubus mikroskopu. Je složen ze zevní trubice, do které je zasunuta vnitřní posuvná trubice. Zevní trubice je na konci spojená s revolverovým měničem objektivů. Do horní části vnitřní trubice je zasunut okulár. Mikroskopy jsou buď monokulární, nebo binokulární, které umožňují pozorovat zároveň oběma očima. R e v o r v e r o v é     z a ř í z e n í umožňuje snadnou výměnu objektivů během mikroskopování. Je složeno ze dvou kulových vrcholíků, které jsou v poněkud šikmé poloze připevněny exentricky k tubusu. Horní vrchlík je pevně spojen s tubusem, jediný otvor je umístěn v optické ose mikroskopu. Ve spodní ose mikroskopu. Ve spodním vrchlíku je tři až pět otvorů se závity pro upevnění objektivů. Závity objektivů jsou normalizované, takže je možno používat v mikroskopu objektivů různých výrobců. Spodní vrchlík je otočný, každému objektivu odpovídá pružinová západka umístěná tak, aby objektivy byly umístěny v optické ose. Optická osa je tvořena paprskem procházejícím středem čoček osvětlovacího zařízení, zařazeného objektivu a okuláru.M a k r o m e t r i c k ý   š r o u b (tzv.makrošroub) slouží k hrubéme posunu tubusu a tedy i celé soustavy objektivů a okuláru. Makrometrický šroub je velký, u monokulárů bývá umístěn na horní části nosiče tubusu, u binokulárů v dolní části. M i k r o m e t r i c k ý   š r o u b (tzv. mikrošroub) slouží k jemnému posunu tubusu. Je nezbytný při zaostřování silně zvětšujících objektivů. Mikrometrický šroub je mnohem menší než makrometrický, na levé nebo na pravé straně mívá měřítko pro odečítání výšky posunu. Na otočném bubnu je 50 dílů, jeden díl=0,002 mm=2µ m. Natočením mikrošroubu do nulové polohy a patřičným doostřením můžeme měřit výšku objektů. Vypočteme ji snadno přímo v µ m podle natočených dílků, násobených 2x. Mikrometrický šroub má omezený pohyb v obou směrech otáčení - při delším otáčení na jednu nebo druhou stranu se posun zarazí. Proto bývá na sáňkách mikrometrického posuvu ryska, která se pohybuje při otáčení mikrometrickým šroubem. Na pevné části nosiče tubusu jsou dvě nepohyblivé rysky, které ukazují rozsah posunu (cca 2 mm).2. Optická část mikroskopu je nejdůležitější. Skládá se ze dvou systémů čoček:a) objektiv = soustava čoček na dolní části tubusu (v revolveru) u objektub) okulár = soustava čoček na horním konci tubusu (u oka pozorovatele)Objektivy i okuláry jsou kombinací rozptylek a spojek z různých druhů skla, aby byly co nejvíce kompensovány vady čoček a zajištěna pokud možno nejlepší ostrost a kresba.O b j e k t i v y slouží k prvotnímu zvětšení předmětu. Na povrchu kovové objímky je vyryto několik údajů. Pod značkou výrobce bývá umístěno výrobní číslo objektivu (vhodné poznamenat pro případ záměny nebo zcizení). Na protilehlé straně objímky bývá většími číslicemi označeno zvětšení, pod kterým bývá menšími číslicemi označena numerická apertura. Obě tyto hodnoty mají základní význam pro funkci objektivu.Numerická apertura určuje prospěšné zvětšení, rozlišovací schopnost a světelnost objektivu i hloubku obrazu. Numerická apertura je vyjádřena číslem, které se rovná sinu polovičního otvorového úhlu, násobeného indexem lomu prostředí (n) mezi frontální čočkou objektivu a objektem. U slaběji zvětšujících objektivů je tímto prostředím vzduch (index lomu světla je 1,0). U silně zvětšujících objektivů tvoří prostředí mezi frontální čočkou objektivu a objektem imerzní olej (index lomu světla je 1,515). Index lomu imerzního oleje je blízký indexu lomu skla (1,52). V některých případech je používáno místo imerzního oleje vody (index lomu je 1,33).Rozlišovací schopnost objektivu je schopnost vytvořit obraz dvou blízkých bodů tak, aby je bylo možno rozlišit okulárem a okem, což je velmi důležité pro pozorování jemných detailů. Rozlišovací schopnost je v přímém poměru s numerickou aperturou.Ohnisková vzdálenost soustavy čoček tvořících objektiv je nazývána ekvivalentní, to je ohnisková vzdálenost, kterou by měla jediná čočka stejné mohutnosti jakou má objektiv. Ohnisková vzdálenost je v nepřímém poměru ke zvětšení - čím silněji objektiv zvětšuje, tím kratší má ohniskovou vzdálenost.Pracovní vzdálenost objektivu je kolmá vzdálenost čelní čočky objektivu od pozorovaného předmětu v poloze, kdy v okuláru vidíme ostrý obraz. Vzhledem k tomu, že nejčastěji pozorujeme objekty přikryté krycím sklíčkem, rozeznáváme ještě volnou pracovní vzdálenost objektivu = kolmá vzdálenost mezi čelní čočkou objektivu a horní plochou krycího sklíčka. Pracovní vzdálenost je v nepřímém poměru ke zvětšení. Čím silnější je objektiv, tím kratší má pracovní vzdálenost. při silnějším zvětšení je pracovní vzdálenost tak krátká, že kdybychom uzavřeli preparát mezi dvě podložní sklíčka (síla sklíčka cca 1 mm) nemohli bychom vůbec zaostřit. Proto přikrýváme objekty sklem krycím o síle cca 0,18 mm. Při použití silnějšího krycího skla nebo silnější vrstvy media (např. kanadského balsámu) nemůžeme pozorovat silně zvětšujícími objektivy.Penetrační schopnost objektivu = hloubka ostrosti, je schopnost ostře kreslit do hloubky preparátu. Mikroskop, jako ostatní optické přístroje, je schopen zobrazovat ostře jenom předměty, které leží v určité vzdálenosti od objektivu. Předměty ležící před touto vzdáleností nebo za ní, jsou neostré. Hloubka ostrosti je v obráceném poměru k numerické apertuře. Slabě zvětšující objektivy s nízkou numerickou aperturou mají poměrně velkou hloubku ostrosti. Silně zvětšující imerzní objektivy s vysokou numerickou aperturou mají nepatrnou hloubku ostrosti. Zobrazují vždy jen jedinou rovinu preparátu - tzv. optický řez.