Skripta_seminar_biochemie

1
TEORIE A ZADÁNÍ ÚLOH


A. AMINOKYSELINY A BÍLKOVINY

Chování disociabilních skupin podstatně ovlivňuje vlastnosti aminokyselin a bílkovin:
pKa1 pKa2
R-CH-COOH ⇔ R-CH-COO- ⇔ R-CH-COO-
  
NH3+ NH3+ NH2


Disociační konstanty jsou uvedeny v tabulce I.



Tabulka I: Disociační konstanty aminokyselin



AK hodnota pKa

pKa1 pKa2 pKa boční řetězec
protonovaný –> deprotonovaný

Ala 2.3 9.9
Gly 2.4 9.8
Phe 1.8 9.1
Ser 2.1 9.2
Val 2.3 9.6
Asp 2.0 10.0 3.9 –COOH –> –COO-
Glu 2.2 9.7 4.3 –COOH –> –COO-
His 1.8 9.2 6.0 –imidazolium+ –> –imidazol
Cys 1.8 10.8 8.3 –SH –> –S-
Tyr 2.2 9.1 10.9 –fenyl-OH –> –fenyl-O-
Lys 2.2 9.2 10.8 -NH3+ –> –NH2
Arg 1.8 9.0 12.5 –guanidinium+ –> –guanidin
Asn 2.0 8.8
Gln 2.2 9.1
Trp 2.4 9.4
Leu 2.4 9.6
Ile 2.3 9.6
Met 2.3 9.2
Thr 2.2 9.1
Pro 2.0 10.6
2
IZOELEKTRICKÝ BOD


Hodnota pH, při kterém je aminokyselina elektroneutrální.

N2+ = H.C kde C je koncentrace aminokyseliny,
K2 + H H je koncentrace H3O+ v izoelektrickém bodě


C1- = K1.C
K1 + H

C1- = N2+

H2 = K1K2 pI = 1/2 (pK1 + pK2)


Izoelektrický bod je aritmetickým průměrem pKa kyselé a bazické skupiny.

Výpočet izoelektrického bodu pro bazickou aminokyselinu: pI = 1/2 (pK2 + pK3)
(pI bazické aminokyseliny je průměrem pKa obou bazických skupin)
Výpočet izoelektrického bodu pro kyselou aminokyselinu: pI = 1/2 (pK1 + pK3)
(pI kyselé aminokyseliny je průměrem pKa obou kyselých skupin)
Výpočet izoelektrického bodu pro Tyr a Cys (K3≈10-9): pI = -1/2 log(K1.K2+K1.K3)

Disociační rovnováhy aminokyselin a peptidů s několika disociabilními skupinami:



3







Peptidy zapisujeme od N-konce k C-konci.


Nejdůležitější L-aminokyseliny

H2N
O
CH3H
2N
O
H2N
O
CH3CH3
H2N
O
CH3
CH3
OHOH OH OH
Gly Ala Leu Ile

H2N
CH3
O
CH3
H2N
OH
O
H2N
O
CH3
OH
OH OH
OH
Ser ThrVal

4
H2N
O
SH
H2N
O
S
CH3
OH OH
Cys Met


H2N
O
OOH
H2N
O
OH
2N
H2N
O
O
OH
H2N
O
O
H2N
OH OH OH OH
Asp Asn Glu Gln

H2N
O
NH
NH
NH2
H2N
O
NH2
OH OH
Arg Lys

H2N
O
NH
N
OH
H2N
OOH
H2N
O
OH
OH
His Phe Tyr

H2N
O
NH
OH
NH
OOH
Try Pro


5
Stanovení primární struktury bílkovin















Edmanovo odbourávání




6


Specifita enzymů a reagens hydrolyzujících peptidové vazby

Reagens Místo hydrolýzy

Trypsin Lys, Arg (C)
Chymotrypsin Phe, Trp, Tyr (C)
Bromkyan Met (C)
Aminopeptidáza odštěpení N-teminální aminokyseliny
Karboxypeptidáza odštěpení C-terminální aminokyseliny



Sekundární struktura bílkovin

Sekundární struktura bílkovin je důsledkem její primární struktury.
Relativní pravděpodobnost, že se daná aminokyselina vyskytne v α-šroubovici,
skládaném listu nebo v reverzní smyčce je udána v následujícím grafu.

7



α-šroubovice

0,54 nm na 1 závit
0,15 nm mezi dvěma aminokyselinovými zbytky



β-skládaný list
0,36 nm mezi dvěma aminokyselinovými zbytky











1. Napište vzorce aminokyselin
a) majících aromatické jádro
b) obsahujících síru
c) majících při pH 7 celkový kladný náboj
d) majících při pH 7 celkový záporný náboj
e) majících alifatický řetězec
8
f) která aminokyselina nemá žádný asymetrický uhlíkový atom a která má dva
asymetrické atomy?


2. Zakreslete titrační křivku a popište inflexní bod
a) slabé kyseliny (kys. octové)
b) aminokyseliny (glycinu)

3. Vypočítejte procentuální obsah disociované formy karboxylové skupiny a NH3+ skupiny
glycinu při pH: 3.0 a 11.0.
(pKa1= 2.4, pKa2= 9.0)

4. Peptidová vazba mezi glycinem a threoninem může vzniknout dvěma způsoby. Napište
vzorce obou variant. Analýzou bylo zjištěno, že izoelektrický bod jednoho z peptidů je při
pH 6,38. O který peptid se jedná? Disociační konstanty glycinu:
pKa1= 2,34, pKa2= 9,60
Disociační konstanty threoninu:
pKa1= 2,63, pKa2= 10,43 (Při výpočtu zanedbáme fakt, že disociační
konstanty koncových skupin dipeptidu se mohou po kondenzaci změnit)

5. Odhadněte celkový náboj peptidu při pH 5 a při pH 9, Vypočítejte izoelektrický bod:
Arg-His-Gly-Phe-Gly-Glu-Lys-Tyr-Cys-Ala
Hodnoty pKa koncových disociabilních skupin jsou:
pKa1=3.6, pKa2=7.9

6. Jakého pH je nutno použít, aby se každý z peptidů pohyboval při elektroforéze na
opačnou stranu. A. Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Gly
B. Val-Cys-Phe-Glu-Ala-Lys-Leu-Gln-Gly
Hodnoty pKa koncových skupin viz př.4

7. Následující směs aminokyselin byla podrobena elekroforéze.
Rozdělte aminokyseliny podle směru migrace při pH 3 a při pH 7:
Gly, Ala, Glu, Lys, Arg, Ser, Asp, Asn

8. Směs aminokyselin byla nasazena na katex v 0.1 mol.l-1 HCl. Napište,
které aminokyseliny se pravděpodobně zachytí a které z kolony vytečou.
Poté byla kolona promývána pufrem o pH 6. Které aminokyseliny se uvolní a které
zůstanou vázány: Gly, Ala, Glu, Lys, Arg, Ser

9. Směs aminokyselin byla nasazena na anex při pH=11
Arg, Ala, Glu, Tyr, Ser
a) Jaký bude celkový náboj každé z aminokyselin? Které aminokyseliny se zachytí na
koloně a které vytečou?
b) Poté byl na kolonu nasazen pufr o pH=8. Jaký bude celkový náboj každé
aminokyseliny a které aminokyseliny z kolony vytečou?

9
10. Směs aminokyselin byla nasazena na katex v 0.1 M HCl.
Vypočítejte izolelekrický bod každé z aminokyselin.
Napište pořadí, v jakém se budou tyto látky z kolony eluovat při postupném zvyšováni
pH:
Glu, Ala, His, Lys, Tyr

11. Směs aminokyselin byla nasazena na anex při pH 10. Které aminokyseliny se
nezachytí a které zůstanou vázány: Cys, Glu, Ser, Ala, Lys, His

12. Jaké musí být pH pufru, aby bylo možno od sebe oddělit tyto dva peptidy:

a) na sloupci katexu: NH2-Ala-Glu-Gly-Tyr-Lys-COOH (I)
NH2-Gly-Asp-His-Tyr-Lys-COOH (II)

b) na sloupci anexu: NH2.Ser.Tyr.Met.Glu.His.Phe.Arg.Gly.COOH (III)
NH2.Val.Cys.Phe.Glu.Ala.Lys.Leu.Gln.Gly.COOH (IV)

Jaký bude náboj každého peptidu při tomto pH. Popište, zda se peptid zachytí na koloně
nebo vyteče.


13. Směs aminokyselin byla nasazena na katex (Dowex 50) při pH 1.0. Eluce byla
provedena gradientem rostoucího pH. Odhadněte pořadí eluce aminokyselin: Gly, Asp,
Tyr, Ala, His, Arg


14. Tetrapeptid byl zpracován 2,4 DNFB a hydrolyzován. Značenou aminokyselinou byl
2,4-DNFB-valin a lysin. Hydrolýza trypsinem dala dva štěpy, z nichž první obsahoval
aminokyselinu, která po redukci LiBH4 dává CH2(NH2)CH2OH a navíc obsahuje
aminokyselinu, která se ninhydrinem barví žlutě. Určete sekvenci tohoto peptidu.


15. Napište, jak byste stanovili sekvenci následujícího peptidu pomocí selektivní
hydrolýzy trypsinem a 2,4-dinitrifluorbenzenu.

NH2-Ala-Lys-Glu-Gly-COOH

Při dělení meziproduktu hydrolýzy trypsinem použijte metodu iontoměničové
chromatografie, popište její podmínky.


16. Určete primární strukturu peptidu P na základě následujících reakcí:
a) redukce β-merkaptoethanolem pokytne dva peptidy B a C
b) Po působení DNFB na peptid P a kyselé hydrolýze v přítomnosti β-merkaptoethanolu
získáme následující aminokyseliny: DNP-Asp, DNP-Leu, 2 Lys, 2 Cys, 1 Gly, 1 Glu, 1
Met, 1 Phe, 1 Ala
10
c) peptid B je podroben působení chymotrypsinu , získáme Ala, hydrolýza trypsinem
dává 2 tripeptidy. Sangerova metoda aplikovaná na tyto 2 tripeptidy prokázala
přítomnost DNP-Leu, DNP-Cys
d) působením bromkyanu na peptid C získáme Glu, trypsinolýza dává jeden dipeptid a
jeden tripeptid: Sangerova metoda aplikovaná na tento tripeptid prokázala přítomnost
DNP-Asp
Jaká je struktura, B, C a P?


17. Složení heptapeptidu P je následující:
Glu, Ala, Lys, Arg, Cys, Met, Tyr
a) aminopeptidáza a karboxypeptidáza nemají žádný účinek
b) po působení chymotrypsinu vzniká jeden hexapeptid, který po Sangerově reakci
dává DNP-Cys
c) po působení trypsinu vznikají dva peptidy: Jeden tripeptid, který po Sangerově reakci
a hydrolýze dává DNP-Glu a DNP-Lys a dále jeden tetrapeptid, který působením
aminopeptidázy uvolní nejdříve Met a potom Tyr
Určete sekvenci peptidu P


18. Polypeptid byl redukován β-merkaptoethanolem a výsledkem reakce byly dva
peptidy o následující sekvenci:
Asn-Cys-Phe-Thr-Lys-Lys-Trp-Cys-Arg-Ala-Val-Cys
Cys-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Pro-Cys
Nativní peptid byl hydrolyzován thermolysinem: Za experimentálních podmínek
hydrolyzuje tento enzym peptidové vazby v místě aminoskupiny následujících
aminokyselin: Leu, Phe, Trp, Tyr, Val. Byly získány 4 peptidy o tomto složení:

A) Asn, 2 Cys, Val
B) 2 Lys, Phe, Thr
C) Arg, Ala, Trp, Tyr, 2 Cys
D) 2 Cys, Thr, 2 Pro, Phe

Udejte polohu disulfidických můstků nativního peptidu

19. . Po tryptické hydrolýze určitého proteinu byl izolován oligopeptid P o následujícím
složení:
1 Lys, 1 Asp(n), 1 Thr, 1 Glu(n), 1 Val, 1 Ile, 1 Phe, 1 Leu

Sumární náboj peptidu P při pH 6,5 je negativní. Po reakci peptidu s DNFB byl získán
DNP-Thr. Karboxypeptidáza uvolňuje postupně tyto aminokyseliny: Lys, Leu, Ile, Val.
Jestliže je peptid P hydrolyzován chymotryspinem, byl získán oligopeptid o následujícím
složení: 1 Asp, 1 Val, 1 Leu, 1 Ile, 1 Lys
Udejte sekvenci P.


11
20. Primární struktura bílkoviny, jenž obsahuje prolin a úseky, ve kterých následuje
několik aminokyselin se stejným nábojem, znemožňuje tvorbu α-šroubovice. Odhadněte,
které úseky následující bílkoviny by mohly mít sekundární strukturu α-šroubovice:
- Leu-Ala-His-Thr-Tyr-Gly-Pro-Phe-Glu-Ala-Ala-Met-Cys-His-
-Glu-Glu-Asp-Pro-Asp-Gly-Met-Gly-Cys-Ala-Phe-His-

Jak by vypadala situace v případě poklesu pH pod oblast disociační konstanty
karboxylových skupin.

21. Určitý peptid je silným inhibitorem vedení nervového vzruchu. Analýza prokázala
následující aminokyselinové složení: 5 Ala, Lys, Phe. Reakce intaktního peptidu s 2,4-
DNFB prokázala po hydrolýze přítomnost DNF-alaninu. Štěpení pomocí trypsinu dalo
tripeptid o (Lys, 2 Ala) a tetrapeptid (3 Ala, Phe). Štěpení pomocí chymotrypsinu poskytlo
hexapeptid a volný fenylalanin. Napiště sekvenci tohoto peptidu.

22. Určitý protein o sekvenci Met-Ala-(Leu-Phe-Ala)3-(Leu-Met-Phe)3-Pro-Ans-Gly-Met-
Leu-Phe je zakotven svým NH2 koncem v hydrofobním sektoru cytoplasmatické
membrány. Pokuste se předpovědět jeho sekundární strukturu. Po mutaci byly všechny
Leu zbytky nahrazeny Asp. Může to způsobit změnu sekundární struktury?

23. Při denaturaci bílkovin dojde vždy

a) ke změně primární struktury
b) " sekundární struktury
c) " terciární struktury
d) " kvarterní struktury
e) " molekulové hmotnosti



24. Jaká je délka bílkovinného řetězce obsahujícího 153 aminokyselin,
a) pokud byl byl zcela ve formě α-šroubovice a zcela ve formě β-skládaného listu
b) celková délka molekuly určité bílkoviny (153 aminokyselin) obsahující pouze α-
šroubovici a β-skládaný list je 4,2 .10-6 cm. Vypočítejte, jaká frakce molekuly obsahuje
α-šroubovici.


25. Jeden vlas roste průměrnou rychlostí 20 cm za rok. Vlas je tvořen α-keratinem
složeným z α-šroubovice. Vypočítejte rychlost syntézy peptidových vazeb za jednu
vteřinu.

26. Buňka E. coli obsahuje 25 000 ribosomů. Pokud by strukturální proteiny ze
všech těchto ribosomů byly nataženy do maximální délky (β-šroubovice), kolikrát by
mohly ovinout buňku E. coli. Předpokládejte průměr ribosomů 18 nm o specifické
12
hmotnosti 1, obsahující 40% hmotnosti strukturálních proteinů. Průměrná molekulová
hmotnost aminokyseliny je 120. Buňka E. coli je sférická o průměru 1 µm.

27. Vypočítejte specifickou hmotnost molekuly tropokolagenu, kterou lze považovat za
válec o délce 0,28 µm a o průměru 1,4 nm. Obsahuje 3 polypeptidické řetězce se 1000
aminokyselinovými zbytky. Průměrná molekulová hmotnost 1 aminokyseliny je 120.

28. Následující látky jsou velmi často používány při
studiu bílkovin :
1/ CNBr
2/ močovina
3/ merkaptoethanol
4/ karboxypeptidáza
5/ 6 N HCl
6/ ninhydrin
7/ 2,4-dinitrofluorbenzen

a) Která z nich se používá označení NH2 konce bílkoviny?
b) Která by byla použita pro štěpení peptidické vazby na
karboxylovém konci methioninu?
c) Která by byla použita pro štěpení intermolekulárních nebo
intramolekulárních disulfidických můstků?
d) Která látka se používá pro potlačení vodíkových vazeb?



13
B. CUKRY

Nejdůležitější D-sacharidy:


O
CH2
H
H
OH
H
OH
OH
H OH
H OCH2
H
H
OH
H
OH
H
OHOH
H O
CH2
H
OH
H
H
OH
OH
H OH
H
OH OH
OH
O
CH2
H
H
OH
H
OH
NH2
H OH
H
OH
OCH2
H
OH
H
H
OH
OH
CH2OHOH OCH2
H
OH
H
OH
H
H
OHOH
OCH2
H
OH
H
H
OH
H
OHOH
α-D-glukopyranosa α-D-mannopyranosa α-D-galaktopyranosa
α-D-fruktofuranosa β-D-ribofuranosa
β-D-arabinofuranosa
O
H
H
OH
H
OH
OH
H OH
H
OHO
O
CH2
H
H
OH
H
OH
OH
H
OH
O
kys. α -D-glukuronová
α−D-glukosamin
kys. D-glukonová


1. Nejjednodušší ketosa je a) trehalosa b) fruktosa
c) erythrulosa d) dihydroxyaceton

2. Ketosy mají poloacetalový hydroxyl na uhlíku č.
a) 1 b) 2 c) 3 d) 6

3. Mutarotace je důsledkem přeměny
a) aldosy na ketosu nebo naopak
b) hexosy na pentosu "
c) formy D- na L- "
d) formy α- na β-

4. Napište vzorce následujících disacharidů:
14
a) 4-O-α -D-glukopyranosyl-D-glukosa
b) 4-O-β -D-galaktopyranosyl-D-glukosa
c) α-D-mannopyranosyl-α -D-glukopyranosid
d) 4-O-β -D-mannopyranosyl-D-galaktosa
e) β-D-galaktopyranosyl-β -D-glukopyranosid

5. Která OH skupina glukosy je nejreaktivnější
Napište vzorec reakčního produktu D-glukosy s methanolem v kyselém prostředí.
Napište vzorec produktu reakce galaktosy se silnými alkylačními činidly (CH3I,
dimethylsulfát). Tento produkt byl dále podroben mírné kyselé hydrolýze. Napište vzorec
výsledné látky.

6. Napište vzorec produktu redukce D-glukosy amalgámem sodíku. Napište
vzorec produktu oxidace D-mannosy slabými oxidačními činidly (NaIO) a silnými
oxidačními činidly (HNO3).

7. Laktosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a poté hydrolyzována zředěnou HCl.
Napište vzorce produktů.

8. Kyselá hydrolýza trisacharidu dává D-glukosu a D-galaktosu v poměru koncentrací 2:1.
Úplná methylace trisacharidu a následná hydrolýza dává tyto produkty:
2,3,6-tri-O-methyl-D-galaktosa
2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glukosa
2,3,4-tri-O-methyl-D-glukosa
Napište vzorec trisacharidu (jsou možné dvě varianty).

9. 3-O-α-D-mannopyranosyl-D-glukosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a pak
hydrolyzována zředěnou HCl. Napište vzorce výsledných produktů.

10. 6-O-α-D-galaktopyranosyl-D-glukosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a pak
hydrolyzována zředěnou HCl. Napište vzorce výsledných produktů.


11. Po methylaci disacharidu dimethylsulfátem a jeho hydrolýze zředěnou HCl byly
získány následující sacharidy:

2,3,4,6-tetra-O-methylgalaktosa
2,3-di-O-methylribosa
Napište vzorec tohoto disacharidu

12. Při úplné metylaci disacharidu a hydrolýze ve zředěné HCl byly získány následující
produkty:
a) 1,3,6-tri-O-metyl-D-fruktosa
2,3,4,6-tetra-O-metyl-D-galaktosa
Napište vzorec tohoto disacharidu.
15

b) kys. 2,3,4-tri-O-methylmannuronová
2,3,4,6 tetra-O-methylglukosa

Napište vzorec tohoto disacharidu. (Předpokládejte, že eventuální methylester kyseliny se
při hydrolýze v HCl zcela hydrolyzoval)


13. Napište vzorec: 3-O-β -D-mannopyranosyl-D-fruktosy. Tento disacharid byl metylován
pomocí metyljodidu a hydrolyzován v slabé HCl. Napište vzorec produktu.


16
C. LIPIDY

Nejdůležitější přirozené mastné kyseliny:

OH
O
OH
O
kys. palmitová
kys. stearová




10 9
OH
O
101213 9
OH
O
101213 9
OH
O
1516
91112 568
OH
O
1415
kys. olejová (18:1) ∆9
kys. linolová (18:2) ∆9,12
kys. linolenová (18:3) ∆9,12,15
kys. arachidonová (20:4) ∆5,8,11,14











17
Fosfolipidy:

O
O O
R1
O
R2
O
P
O
OH O
R
R = H
kys. fosfatidová





R =

NH2
CH2
CH2 CH2
N+
CH2
CH3 CH
3
CH3 NH2
CH
CH2
O
OH
ethanolamin
OH
OH
OH
glycerolcholin serin
OH
H
OH
OH
H
OH
OH
H H
myoinositol
OH
H



1 Všechny lipidy jsou po chemické stránce
a) amidy b) estery c) etery d) acetaly

2. Tekutost lipidů je úměrná obsahu
a) vody b) volného glycerolu
c) nasycených mastných kyselin
d) nenasycených mastných kyselin

3. Napište vzorce těchto mastných kyselin:
kys. olejová (18:19), kys. linolová (18:29,12)
kys. palmitolejová (16:19) kys. linolenová (18:39,12,15)

18
4. Napište vzorce těchto fosfolipidů:
a) kys. dipalmitoylfosfatidová
b) 1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin
c) dipalmitoylfosfatidylethanolamin
d) 1-stearoyl-2-palmitoylfosfatidylglycerol
e) dioleylfosfatidylserin
f) 1-stearoyl-2-linoloylfosfatidylserinu.
(kys. linolová 18:2 ∆9,12.)
g) napište vzorec 1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylglycerolu.
(kys. olejová 18:1∆ 9.)

Jaký bude jeho celkový náboj při pH 7.5 (pKa fosfátu = 6.8, kys.fosforečná: pK1=2.2,
pK2=7,2, pK3=12,3, serin: pKa1=2.1, pKa2=9.2).


5. Napište vzorec cholesterolu a očíslujte jej.

6. Fosfolipidy jsou důležitými složkami biomembrán, kterým udělují kladné nebo záporné
náboje. Jaký bude celkový náboj jednotlivých fosfolipidů a)-c) v úloze 4, bude -li pH
prostředí 5 a 8. (pKa fosfátové skupiny je v oblasti 6-7).

7. Vaječný lecithin je heterogenní směs diacylfosfatidylcholinů, z nichž 70% má v poloze 1
kys. palmitovou a 61% v poloze 2 kys. olejovou. Tento lecithin je dostupným zdrojem při
syntéze definovaných fosfolipidů. Navrhněte metody syntézy:

a) dipalmitoylfosfatidylcholinu
b) 1-palmitoyl-2-stearoylfosfatidylcholinu
c) distearoylfosfatidylethanolaminu

Použijte těchto údajů:

1. Selektivního odštěpení acylu v poloze 1 lze dosáhnout fosfolipázou A1, v poloze 2
fosfolipázou A2.
2. Chemicky lze obě mastné kyseliny odštěpit mírnou alkalickou hydrolýzou za katalýzy
tetrabutylamonium hydroxidem.
3. Acylace glycerolu se provádí příslušnými acylchloridy.
4. Hydrolýzu vazby mezi fosfátem a bazí katalyzuje fosfolipasa D. Rovnovážná konstanta
této reakce je rovna 1.



19
D NUKLEOVÉ KYSELINY

Nukleové baze

NH N
N N
NH2
NH N
N NH
O
NH2
Guanin
NH
NH
O
O
CH3
Thymin
NH
NH
O
O
Uracil
NH
N
O
NH2
Cytosin
Adenin




Nukleosidy

NO
N
N
OHOH
N
NH2
OH
Adenosin
OH
O
OH
N
N
N
N
NH2
Deoxyadenosin
OH
O
OH
N N
O
O
CH3
OH
O
OH
N N
OH
O
O
DeoxythymidinUridin