Skripta_seminar_biochemie

Primární struktura nukleových kyselin
20


Metody stanovení sekvence nukleových kyselin:

Enzymy hydrolyzující nukleové kyseliny mohou být specifické na DNA, RNA, nebo bez
specifity

Fosfomonoesterázy:
hydrolyzují teminální fosfátovou skupinu


Fosfodiesterázy:
hydrolyzují fosfodiesterovou vazbu:
exonukleázy (5´- exonukleázy uvolňují 3´P nukleosidy, 3´- exonukleázy
uvolňují 5´P nukleosidy)
endonukleázy uvolňují oligonukleotidy, jsou obvykle substrátově specifické
(desoxyribonukleáza, ribonukleáza)

Polynukleotidkináza: Fosforyluje volnou 5´OH skupinu pentózy pomocí ATP

21
A5´ 3´
P
P
5´ P
3´ U
P
3´
3´
OH
G
C5´
fosfomonoesteráza
3´exonukleáza
5´exonukleáza
endonukeáza (ribonukleáza)



Maxam-Gilbertova metoda sekvenace nukleových kyselin.:

1. Označení konce nukleové kyseliny pomocí ATP (32P)
2. Specifická chemická hydrolýza v místě:
G: působením DMS za tepla
G + A: působením kyseliny a DMS
C: působením hydrazinu v prostředí 5 M NaCl
C + T: působením hydrazinu
3. Elekroforéza získaných fragmenů za denaturačních podmínek (rychlost migrace je
nepřímo úměrná počtu nukleotidů)
4. Autoradiografie gelu

Sekundární struktura DNA

Základní strukturou DNA je dvojitá šroubovice stabilizovaná vodíkovými vazbami mezi
A-T a G-C.
Dvojitá šroubovice obsahuje 10 pb na jednu otáčku a vzdálenost mezi dvěma
následujícími pb je 0,34 nm.
(méně běžná A-šroubovice DNA obsahuje 11 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousední
bazemi je 0,23 nm.
Z-šroubovice DNA obsahuje 12 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousedními pb je 0,38
nm).






22

Genetický kód mRNA prokaryontů:




1. Napište vzorce adeninu, nukleosidu a nukleotidu od něho odvozeného

2. Roztok obsahující AMP a GMP měl absorbanci A260 = 0.652 a A280 = 0.284, vypočítejte
koncentraci AMP a GMP v roztoku, jestliže pro AMP je ε při 260 = 15.4 x 103 M-1.cm-1, ε
při 280 = 2.5 x 103 M-1.cm-1. Pro GMP ε při 260= 11.7 x 103 M-1.cm-1, ε při 280 = 7.7 x
103 M -1.cm-1.

3. Napište úplnou strukturu ribodinukleotidu a desoxyribodinukleotidu složeného z A a
C.

4. Vypočítejte průměrnou molekulovou hmotnost jednoho nukleotidového zbytku DNA a
RNA, za předpokladu, že baze jsou přítomny v ekvimolárních koncentracích.
Nezapomeňte na kondenzaci vody při vytvoření esterové vazby!
(Molekulové hmotnosti složek: A = 135, G = 151, C = 111, U = 112, T = 126, ribóza
150, kys. fosforečná = 98).

5. Schematické znázornění sekvence RNA (zapsáno od volného 3' konce k 5' konci) je
následující:

UpCpUpApGpAp

Napište produkty hydrolýzy této RNA pomocí následujících enzymů:

a) fosfomonoesteráza
b) fosfodiesteráza hadího jedu (3´- exonukleáza)
c) fosfodiesteráza ze sleziny (5´- exonukleáza)
23
d) ribonukleáza T1 (hydrolýza v místě G, vznik 3´P oligonukleotidu)
e) ribonukleáza U2 (hydrolýza v místě A nebo G, vznik 3´P oligonukleotidu)


6. Oligonukleotid pocházející z DNA má následující sekvenci (zapsáno od volného 5'
konce k 3' konci):

pApCpTpTpApG

5´ terminální nukleotid byl označen 32P. Jaké oligonukleotidy získáme po
působení fosfodiesterázy hadího jedu (viz výše). Které z nich budou značeny 32P?
Které oligonukleotidy získáme hydrolýzou pomocí desoxyribonukleázy II a které z nich
budou značeny 32P (desoxyribonukleáza II je endonukleáza uvolňující 3´P
oligonukleotidy).

7. Oligoribonukleotid X je složen z následujících bazí: 2A, 2C, U, G.
a) po působení fosfodiesterázy z hadího jedu se po krátké době uvolní pC.
b) hydrolýzou pomocí pankreatické ribonukleázy získánme C, dinukleotid obsahující A a
C a dále trinukleotid obsahující A, G a U.
(penkreatická ribonukleáza je endonukleáza a působí v místě C a U za vzniku 3´P
oligonukleotidů).
c) hydrolýzou pomocí ribonukleázy T2 (hydrolýza v místě A za vzniku 3´P
oligonukleotidů) získáme pAp, dinukleotid obsahující U a C a trinukleotid obsahující A,
G a C.
Určete sekvenci oligoribonukleotidu


8. Udejte sekvenci oligodesoxyribonukleotidu stanovovanou Maxam-Gilbertovou
metodou. Po autoradiografii byl získán následující obraz:


G + A G C + T C

start












24







9. Při replikaci řetězce DNA --AGCGTAG-- byl vytvořen komplementární řetězec o jaké
sekvenci ? Jaká bude sekvence RNA vytvořená při transkripci.


10. Napište sekvenci komplementární k uvedenému řetězci DNA, vyhledejte úseky
obsahující palindrom.

a/ GATCAA, b/ TGGAAC, c/ GAATTC, d/ ACGCGT, e/ CGGCCG,
f/ TACCAT

11. Vypočítejte molekulovou hmotnost jednoho průměrného páru bazí
(molekulová hmotnost A = 135, T = 126, G = 151, C = 111, desoxyribóza 134, kys.
fosforečná 98. Nezapomeňte na odštěpení vody při tvorbě esterové vazby)
Jaká je molekulová hmotnost molekuly DNA o délce 1 µm v Da a hmotnost v gramech?

12. Jaterní buňka krysy obsahuje 10-11 g DNA. Tato DNA je rovnoměrně rozdělena do
42 chromosomů buňky.
a) Jaká je molekulová hmotnost DNA (1 chromosom obsahuje jednu molekulu DNA).
b) Vypočítejte počet párů bazí DNA obsažené v jednom chromosomu a jeho délku
(vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm, molekulová hmotnost jednoho
páru bazí je v průměru 617,5).

13. Molární složení guaninu + cytosinu v DNA určité bakterie je 67,2%. Jaký je poměr
mezi purinovými a pyrimidinovými bazemi? Jaké je molární složení v procentech
jednotlivých bazí této DNA.

14. Při analýze byla zjištěna změna v aminokyselinovém složení bílkoviny, jejíž gen byl
mutován. Vyberte z následujících změn ty případy, které jsou výsledkem mutace
provedené změnou jedné baze.
Phe → Leu Lys → Ala Ala → Thr Phe → Lys Ile → Leu
His → Glu Pro → Ser

15. DNA fága lambda vzniklá deleční mutací má délku 13, 6 µm namísto 16, 49 µm.
a) Vypočítejte, kolik pb tomuto mutantovi chybí
b) Jaký je rozdíl v molekulové hmostnosti a hmotnosti v gramech obou DNA
c) Část, u které byla provedena delece odpovídá sekvenci kódující protein P. Jaká je
molekulová hmotnost tohoto proteinu. Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny je
140.

25
16. Směs nukleosidtrifosfátů značených 32P na γ-fosfátu byla inkubována
s RNApolymerázou: Po určité době byla zjištěna inkorporace 100 molekul značeného
fosfátu do výsledného produktu. Tentýž pokus byl proveden se směsí
nukleosidtrifosfátů značených na fosfátu α. Byla zjištěna inkorporace 3.104 molekul
fosfátu do značeného produktu.
Jaký počet řetězců RNA byl syntezován a jaká je jejich průměrná délka?

17. Aminokyselinová sekvence C-terminální oblasti bílkoviny a odpovídající kódující
sekvence DNA jsou následující:
Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg
TTT GAG ATT CTG GAG CGG CGG
Popište mutace, které by mohly vnést do této sekvence restrikční místo TT/CGAA
a jiné restrikční místo A/GATCT a to za podmínky, že nedojde ke změně sekvence
aminokyselin ve vzniklém peptidu.

18. DNA bakteriofága má následující složení bazí: C 19%, A 25%, T 33% a G 23%.
a) Co je na této DNA neobvyklé a čím se dá její struktura charakterizovat
b) Tato DNA byla použita jako matrice in vitro při reakci katalyzované DNA
polymerázou. Jaké bude složení bazí této nově syntezované DNA?
c) pokud by množství nasyntezované DNA bylo stejné jako je množství matrice, jaké je
celkové složení bazí (to je DNA matrice + DNA syntezované in vitro)
d) mRNA syntezovaná jakožto odpověď na infekci fágem má následující složení: C
18%, A 25% U 34% G 23%. Který řetězec DNA byl použit pro syntézu RNA?

19. Byla provedena syntéza polynukleotidu mRNA in vitro za použití 90% UTP a 10%
CTP. Tyto polymerní molekuly byly poté použity pro syntézu polypeptidu za přítomnosti
všech 20 t-RNA. Syntezované polypeptidy byly hydrolyzovány a jejich celkové
aminokyselinové složení bylo následující: 81% Phe, 1% Pro, 9% Ser, 9% Leu.
Vypočítejte frekvenci všech kodonů a zdůvodněte odpovídající aminokyselinové složení
polypeptidů.

20. Při pokusu byla enzymově připravena glutaminyl-tRNA značená na glutaminu. Poté
byla tato látka chemicky desaminována za vzniku glutamyl-tRNA. Tato tRNA byla
přidána do bezbuněčné směsi připravené z E. coli a zbavené mRNA. Ke směsi byl
přidán uměle připravený polymer obsahující ekvimolární koncentraci G a A. Kolik
procent glutamátu bude obsahovat syntezovaný polypeptid?

21. Při stanovení primární struktury enzymu bylo zjištěno, že se skládá z 250
aminokyselin. Jaký je minimální počet nukleotidů strukturálního genu tohoto enzymu?
Při bodové mutaci tohoto strukturálního genu došlo k náhradě jednoho serinu
glutamátem. Tento fakt se projevil ztrátou enzymové aktivity. Co z tohoto faktu lze
vyvodit?




26
E. TERMODYNAMIKA ENZYMOVÝCH REAKCÍ

Základní vztahy:
E
A + B ⇔ C + D

∆G = ∆Go + RTln [C][D] R=8,314 J.K-1.mol-1
[A][B]
povaha aktuální
reakce koncentrace

∆Go = -RTln Keq




Tab.II Hodnoty ∆Go hydrolýzy důležitých vazeb

∆Go [kJ.mol-1]

fosfoenolpyruvát ⇔ pyruvát -61.8
karbamoylfosfát ⇔ karbamát -51.4
acetylfosfát ⇔ k.octová -43.0
kreatinfosfát ⇔ kreatin -43.0
difosfát ⇔ fosfát -33.4
acetylKoA ⇔ acetát -31.3
ATP ⇔ ADP -30,5
ADP ⇔ AMP -30.5
glukosa-1-P ⇔ glukosa -20.9
Glukosa-6-P ⇔ glukosa -12.5
glycerol-3-P ⇔ glycerol -8.4



1. Vypočítejte ∆Go reakce přeměny dihydroxyacetonfosfátu na glyceraldehydfosfát, je-li
Keq= 0.0475 při 25oC. Vypočítejte ∆G reakce, je-li koncentrace dihydroxy AP 2.10-4mol.l-1
a glyceraldehyd P 3.10-6 mol.l-1.

2. Vypočítejte ∆G hydrolýzy ATP na ADP a Pi, jsou-li koncetrace ADP a ATP ekvimolární
a koncentrace fosfátu při 25 oC: a) 1 mol.l-1, b) 0.001 mol.l-1.
c) Jaká je ∆G hydrolýzy za aktuálních podmínek hydrolýzy ve svalu, kde je koncentrace
ATP = 5 mmol.l-1, ADP = 0.5 mmol.l-1, Pi= 1 mmol.l-1při 25oC.


27
Vzorce některých energeticky významných sloučenin:



O P OH
OH
O
O P O
O
O
O P O
O
O
P OH
O
OH
OH P
OH
O
OH P
OH
O
OHPOH
O
P OH
OH
O
CH2
OHO
O
NH2
O
CH3
O NH
NH
N
CH3
OH
O
Fosfoenolpyruvát Karbamoylfosfát Acetylfosfát
Difosfát Kreatinfosfát
O
CH2
H
H
OH
H
OH
OH
H OH
HO
CH2
H
H
OH
H
OH
OH
H
H
OH O
O O P OH
OH
O
OH
OH
Glukosa-1-fosfát Glukosa-6-fosfát Glycerolfosfát
S KoAO
CH3
Acetyl-KoA


3. Vypočítejte ∆G hydrolýzy difosfátu na fosfát, je-li aktuální koncentrace difosfátu 1
mmol.l-1, koncentrace fosfátu 150 mmol.l-1. ∆Go reakce je -33.4 kJ.mol-1, teplota 25oC.
Vypočítejte rovnovážnou konstantu reakce.

4. Jaká musí být koncentrace malátu, aby reakce:

malát ⇔ fumarát + H2O

byla v rovnováze. Koncentrace fumarátu je 1 mmol.l-1, ∆Go reakce je +3.1 kJ.mol-1, t=
25oC.



28
Spřažené reakce:

∆G1 A ⇔ C + D K1= [C].[D]
[A]
∆G2 C ⇔ G K2= [G]
[C]

∆G1+2 A ⇔ D + G K1+2= [D].[G] = K1.K2
[A]

∆Go1+2= -RTln K1+2= -RT(lnK1+lnK2)
∆Go1+2= ∆Go1 + ∆Go2
∆G1+2 = ∆Go1+2 + RT ln [D].[G]
[A]



5. Vypočítejte ∆Go a Keq reakce při 25oC:

ATP + CH3COCOOH ⇔ ADP + CH2C(OP)-COOH

Jaký je rovnovážný poměr koncentrací pyr/PEP, je-li poměr ATP/ADP=10.

6. Tvorba acetyl-KoA probíhá v přítomnosti ATP:

CH3COOH + ATP + HSKoA ⇔ CH3COKoA + AMP + PPi

(PPi je difosfát).

Vypočítejte ∆Go reakce (předpokládejte, že ∆Go hydrolýzy
ATP-⇔ AMP + PPi je stejné jako při vzniku ADP a Pi. PPi je hydrolyzován pyrofosfatázou.
Vypočítejte celkové ∆Go reakce při 25oC. Jaký je vliv hydrolýzy difosfátu?

7. Vypočítejte ∆Go izomerace:

glukosa-6-P ⇔ glukosa-1-P

Jaký je rovnovážný poměr koncentrace obou látek při 25oC. Jaké je G reakce,je-li
koncentrace glukosa-6-P 10 mmol.l-1 a koncentrace glukosa-1-P 2 mmol.l-1?

8. Kreatinfosfát je hlavní zásobní látkou svalu. Jaké je ∆Go reakce:

ATP + kreatin ⇔ ADP + kreatinfosfát.

29
Jaký je rovnovážný poměr kreatin-P/kreatin při 25oC, jsou-li koncentrace ADP a ATP
ekvimolární. Napište vzorec kreatinfosfátu.

9. Koncentrace glukosy v buňce je 1 mmol.l-1, koncentrace glukosa-1-P 0.05 mmol.l-1.
Jaký musí být poměr koncentrací ATP/ADP. aby reakce:

ATP + glukosa ⇔ glukosa-1-P + ADP

byla při 25oC v rovnováze.


10. Vypočítejte ∆Go reakce při 25oC:

sacharosa + Pi ⇔ glukosa-1-P + fruktosa

K dispozici máte tyto údaje:

1/ sacharosa ⇔ glukosa + fruktosa K= 1.35.105
2/ glukosa-1-P ⇔ glukosa + Pi ∆Go = -20.9 kJ.mol-1

Jaká bude volná energie reakce ∆G za aktuálních podmínek:
Koncentrace Pi 1 mmol.l-1, sacharosa 0.5 mmol.l-1, glukosa-1-P a fruktosa 4 mmol.l-1.
Je možno glykosidovou vazbu sacharosy počítat mezi makroergickou vazbu, pokud mezi
makroergické vazby počítáme vazby se standartní volnou energií hydrolýzy nižší než -10
kJ.mol-1?


11. Vypočítejte stand. volnou energii tvorby aktivované glukosy při 25°C:

glukosa-1-P + ATP ⇔ ADP-glukosa + PPi

K dispozici máte tyto údaje:

rovnovážná konstanta hydrolýzy:
1/ ADP-glukosa ⇔ glukosa + ADP K= 722
2/ ATP ⇔ ADP + Pi ∆Go= - 30.5 kJ/mol
3/ glukosa-1-P ⇔ glukosa + Pi ∆Go = -20.9 kJ.mol-1
4/ hydrolýza PPi: PPi ⇔ 2Pi ∆Go = -33.4 kJ.mol-1

Vypočítejte ∆G hydrolýzy difosfátu za aktuálních podmínek koncentrace při 25oC: Pi = 5
mmol/l, PPi = 2 mmol.l-1.


12. Vypočítejte stand. volnou energii hydrolysy aktivované glukosy při 25°C:

30
ADP-glukosa ⇔ glukosa + ADP

K dispozici máte tyto údaje:

1/ Glukosa-1-P + ATP ⇔ ADP-glukosa + PPi Keq = 2
2/ hydrolýza difosfátu: PPi ⇔ 2Pi ∆Go = - 33.4 kJ.mol-1
3/ Glukosa-1-P ⇔ glukosa + Pi ∆Go = -20.9 kJ.mol-1
4/ ATP ⇔ ADP + Pi ∆Go= -30.5 kJ.mol-1


13. Dokažte výpočtem, zda bude probíhat tato reakce:

glukosa-6-P → fruktosa-6-P

je-li ∆Go = +1,6 kJ.mol-1 a koncentrace fruktosa-6-P 10 mmol.l-1 při 25°C, koncentrace
glukosa-1-P je 1 mmol.l-1. Napiště vzorce glukosa-1-P a fruktosa-1-P.

14. a) Jedním ze způsobů jak může svalová buňka zvýšit koncentraci ATP je následující
reakce:

2 ADP ⇔ ATP + AMP

Vypočítejte, zda je tato reakce za standardních podmínek exergonická nebo
endergonická, pokud předpokládáte, že ∆Go hydrolýzy u dvou fosfátových vazeb
nukleotidu je stejná -30 kJ.mol-1.
b) Jak by tomu bylo v případě, kdyby ∆Go fosfátu č.2 byla -28 kJ.mol-1?
Vypočítejte hodnotu ∆G výše uvedené reakce za aktuálních koncentrací:

ATP 0,1 mmol.l-1, ADP 1 mmol.l-1, AMP 0,05 mmol.l-1.




31
F ENZYMY


Hlavní skupiny enzymů podle typu reakce:

1. Oxidoreduktasy

A-+ B ⇔ A + B- 2. Transferasy

A-B + C ⇔ A + B-C


3. Hydrolasy

A-B + H2O ⇔ A-H + B-OH 4. Lyasy (synthasy)

X Y
 
A –B ⇔ A ==B + X-Y

5. Izomerasy

X Y Y X
   
A –B ⇔ A - B 6. Ligasy (synthetasy)

A + B ⇔ A-B


SYSTEMATICKÉ NAZVOSLOVÍ ENZYMŮ

1. Oxidoreduktasy
donor:akceptor-oxidoreduktasa
(např. glukosa:O2-oxidoreduktasa, triviálně glukosaoxidasa)

2. Transferasy
donor:akceptor-skupinatransferasa
(např. ATP:glukosa-6-fosfotransferasa, triviálně glukokinasa či hexokinasa)

3. Hydrolasy
substrát-skupinahydrolasa
(např. protein-amidohydrolasa, triviálně proteinasa)

4. Lyasy (synthasy)
substrát-skupinalyasa
32
(např. citrát-oxalacetátlyasa, triviálně citrátsynthasa)

5. Isomerasy
neujasněné názvosloví, enzym může končit názvem:
racemasa (katalyzuje stereochemické změny substrátu, např.alaninracemasa)
epimerasa (např. UDP-glukosa-4-epimerasa)
isomerasa (obecně substrát-děj-isomerasa, např. maleinát-cis-trans-isomerasa)
mutasa (chorismátmutasa)

6. Ligasy (syntetasy)
substrát:substrát-ligasa(tvořící nukleotid)
(např. alanin:tRNAAla-ligasa(tvořící AMP), triviálně alanyl-tRNA-synthetasa)

KINETIKA ENZYMOVÝCH REAKCÍ

k1 k2
E + S ⇔ ES → E + P
k-1

Km= k-1+ k2 Michaelisova konstanta
k1

Je-li k2 k-1, pak Km= k-1 Disociační konstanta
k1 komplexu ES

vo= k2[ES]


vo= V.S Rovnice Michaelise-Mentenové
Km + S

Platí-li, že S → ∞ ,
pak [Et] = [ES]
vo= k2[Et] = V Limitní počáteční rychlost

Limitní počáteční rychlost je tedy přímo úměrná koncentraci enzymu.
Pomocí této limitní rychlosti (S → ∞ , T, pH optimum) lze měřit množství enzymu, tzv.
aktivitu.

Aktivita enzymu se udává v následujících jednotkách : 1 IU = 1 µmol.min-1
1 katal = 1 mol.s-1
Číslo přeměny=katalytická aktivita=molekulová (resp.molární) aktivita enzymu=počet
molekul (resp.molů) substrátu přeměněných za jednu sekundu jednou molekulou
(resp.jedním molem) enzymu.


33

Stanovení Km a V - linearizované vztahy:

1 = Km.1 + 1 Vynesení podle Lineweavera-Burka
vo V S V

S = S + Km Vynesení podle Hanese-Woolfa
vo V V

Enzymová inhibice

Inhibice kompetitivní:

Km
E + S ⇔ ES → E + P
Ki
E + I ⇔ EI


Jestliže S→ ∞ , pak EI → 0 , a vo = V
Linearizované vztahy:

1 = Km.(1 + i/Ki).1 + 1
vo V S V

S = S + Km(1 + i/Ki)
Vo V V

Inhibice nekompetitivní:
Km
E + S ⇔ ES → E + P

Ki +S
E + I ⇔ EI ⇔ EIS

Km +I
E + S ⇔ ES ⇔ EIS

Linearizované vztahy:

1 = Km.(1 +i/Ki).1 + 1.(1 + i/Ki)
vo V S V

S = S (1 + i/Ki) + Km (1 + i/Ki)
vo V V
34


1. Enzymy v uzavřeném systému
a) posunují rovnováhu reakce ve směru tvorby produktu
b) neovlivňují rovnovážný stav reakce
c) zvyšují ∆ Go reakce
d) snižují "


2. Pojmenujte enzymy katalyzující následující reakce a zařaďte je podle enzymové
nomenklatury (tj. hydrolasa, transferasa, oxidoreduktasa, apod.):

a) oxalacetát + NADH + H+ → malát + NAD+
b) glutamát + pyruvát → oxoglutarát + alanin
c) škrob → (maltosa)n
d) formaldehyd + NADH + H+ → methanol + NAD+
e) fruktosa + ATP → fruktosa-6-fosfát + ADP
f) močovina + H2O → amoniak + CO2
g) Glukosa-6-fosfát → Glukosa 1-fosfát
h) D-alanin + D-alanin + ATP → D-alanyl-D-alanin + ADP + P

3. Vysvětlete rozdíl mezi koenzymem a prostetickou skupinou. Vysvětete roli koenzymu
A v metabolismu, vysvě