- Stahuj zápisky z přednášek a ostatní studijní materiály
- Zapisuj si jen kvalitní vyučující (obsáhlá databáze referencí)
- Nastav si své předměty a buď stále v obraze
- Zapoj se svojí aktivitou do soutěže o ceny
- Založ si svůj profil, aby tě tví spolužáci mohli najít
- Najdi své přátele podle místa kde bydlíš nebo školy kterou studuješ
- Diskutuj ve skupinách o tématech, které tě zajímají
Studijní materiály
Hromadně přidat materiály
Protokol_03
AMOL - Úvod do molekulární biologie a genetiky
Hodnocení materiálu:
Zjednodušená ukázka:
Stáhnout celý tento materiálcytometr, software na vyhodnocování naměřených dat (WinMDI).
Princip flow cytometrického stanovení obsahu DNA:
Buňky jsou označeny fluorescenčním barvivem, které se váže na DNA (obvykle propidium iodid). V průtokovém cytometru je suspenze obarvených buněk vytlačována do velmi tenké kapiláry, kterou buňky procházejí jedna za druhou. V této kapiláře jsou buňky ozařovány úzkým laserovým paprskem a intenzita fluorescence (odpovídající obsahu DNA) každé jednotlivé buňky je zaznamenávána. Výsledkem této analýzy je graf (tzv. histogram) znázorňující relativní počet buněk s daným množstvím DNA v měřené buněčné suspenzi:
Schéma ukazuje rozložení buněk vzhledem k množství DNA v normální rostoucí kultuře. První vrchol (peak) tvoří buňky s normálním (nereplikovaným) množstvím DNA - jedná se o buňky v G1-fázi, druhý vrchol představují buňky s dvojnásobným (tedy zcela zreplikovaným) množstvím DNA - jde o buňky v G2- nebo M-fázi. Mezi těmito dvěma vrcholy se nacházejí buňky v S-fázi, v nichž právě probíhá replikace DNA. Z grafu vyplývá, že buněk v G1-fázi je mnohem více, než buněk v G2- a M- fázích. Z toho lze usuzovat, že G1-fáze je delší, než součet délky G2-fáze a M-fáze. V případě posunu této rovnováhy v histogramu můžeme usuzovat na zástavu buněčného cyklu v určitém stadiu.
Provedení:
Kultura kvasinek S. cerevisiae (termosenzitivní cdc28 mutanta) byla přenesena z permisivní teploty do teploty restrikční a ihned byl z kultury odebrán vzorek buněčné suspenze. Další vzorky byly odebírány v hodinových intervalech. Buňky byly ihned po odebrání fixovány, obarveny propidium iodidem a na flow cytometru byl měřen obsah DNA v jednotlivých buňkách příslušných vzorků. Výsledky měření máte k dispozici v podobě DNA-histogramů. Určete, ve které fázi došlo k zástavě buněčného cyklu, a svůj závěr porovnejte s výsledky pozorování terminálního fenotypu cdc28 mutanty v úkolu 1 tohoto praktika.
Výsledky:
Závěr:
Kontrolní otázky:
1. Vysvětlete, proč termosenzitivní mutanta S.cerevisiae vykazuje při permisívní teplotě standardní (nemutovaný) fenotyp?
2. Ve které fázi se nachází většina normálně se dělících buněk S.cerevisiae?
Praktické cvičení bylo provedeno dne:Podpis vyučujícího:
Vloženo: 26.05.2011
Velikost: 122,50 kB
Komentáře
Tento materiál neobsahuje žádné komentáře.
Copyright 2025 unium.cz
