Biochemie

9. Zápis genetické informace, genetický kód
Genetická informace je zapsána pomocí „abecedy“, sestávající ze čtyř dusíkatých basí adeninu, thyminu, guaninu a cytosinu v řetězcích DNA a adeninu, uracilu, guaninu a cytosinu v řetězcích RNA. Zatímco je genetická informace o sekvenci nukleotidů, resp.dusíkatých basí, v RNA určena sekvencí basí DNA, tedy stejným „jazykem“ basí, je přenos této informace do synthesy peptidového řetězce překladem do jiného „jazyka“ - do sekvence aminokyselin těchto peptidových řetězců.
Vlastní překlad (translace) je realizován prostřednictvím kódu, který je tvořen kombinací všech čtyř basí v DNA. Kódu, který determinuje jednu konkrétní aminokyselinu a který je určen kombinací tří basí (tripletem basí), se říká kodon.
Ze skutečnosti, že se na složení tripletů podílejí čtyři nukleotidy, přesněji čtyři dusíkaté base, vyplývá celkem 43 ( 64 možných kombinací. Tento počet je teoreticky nadbytečný, neboť jak je známo, na stavbě bílkovin se podílí pouze dvacet aminokyselin.
Zmíněná disproporce byla experimentálně objasněna použitím synthetických polynukleotidů, fungujících jako matrice pro synthesu modelových peptidů. Tak bylo zjištěno, že genetický kód není přísně specifický, že některé aminokyseliny jsou určeny několika rozdílnými kombinacemi nukleotidových tripletů. Takovéto genetické kódy byly označeny jako „degenerované“.
Z uvedeného počtu 64 možných kombinací kóduje aminokyseliny 61 tripletů. Tři kodony jsou nesmyslné, tzn. nekódují žádnou aminokyselinu, zakončují pouze synthesu peptidu a nazývají se proto kodony terminační. Biosynthesa peptidového řetězce je naopak zahajována tzv. iniciačním kodonem, determinujícím methionin (u prokaryotů, v chloroplastech a mitochondriích N-formylmethionin).
Genetický kód:
První base
Druhá (střední) base
Třetí base
od 5´ konce
U
C
A
G
3´ konec
Phe
Ser
Tyr
Cys
U
U
Phe
Ser
Tyr
Cys
C
Leu
Ser
„stop“
„stop“
A

Leu
Ser
„stop“
Trp
G
Leu
Pro
His
Arg
U
C
Leu
Pro
His
Arg
C
Leu
Pro
Gln
Arg
A
Leu
Pro
Gln
Arg
G
Ile
Thr
Asn
Ser
U
A
Ile
Thr
Asn
Ser
C
Ile
Thr
Lys
Arg
A
Met
Thr
Lys
Arg
G
Val
Ala
Asp
Gly
U
G
Val
Ala
Asp
Gly
C
Val
Ala
Glu
Gly
A
Val
Ala
Glu
Gly
G
Pozn.:
Triplety AUG a GUG jsou zároveň iniciační kodony, „stop“ kóduje konec proteosynthesy.
Čtení genetického kódu
Genetický kód je čten na buněčných partikulích zvaných ribosomy. Jde o proces již zmíněné translace, spočívající v jednosměrném rozpoznávání kodonů v mRNA antikodony transportních ribonukleových kyselin.
Antikodon je specifický triplet, jehož prostřednictvím se tRNA reversibilně váže ke komplementárnímu kodonu na mRNA. Díky této komplementaritě je zajištěn vstup odpovídající aminokyseliny do synthetisovaného peptidového řetězce.
Genetický kód, který je univerzální (stejný pro všechny organismy a viry), je čten vždy nepřekrývavým způsobem, tj. po jednotlivých tripletech. Tento způsob čtení ovšem vyžaduje přesný počátek čtení, vymezený iniciačním a terminačním kodonem tzv. čtecího rámce.
9.1. Gen
Gen je základní funkční genetickou jednotkou, vyskytující se v následujících formách:
Jako strukturní gen, tj. úsek DNA-řetězce, kódující primární strukturu translačního produktu kterým je peptid (u eukaryotů až po posttranskripčních úpravách RNA). Strukturní gen je  vymezen iniciačním a terminačním kodonem jak na DNA-řetězci, tak i na RNA-řetězci tzv. RNA-virů.
Jako gen pro RNA , tj. úsek DNA-řetězce přepisovaný (ne kodovaný) do primární struktury především tRNA a rRNA, zodpovědných za umožnění průběhu translace, nikoliv za mechanismus translace samotné.
Jako oblast regulace , tj. úsek DNA-řetězce či úsek RNA-řetězce (u RNA-virů), plnící regulační funkci pro zahájení či zastavení určitého molekulárního děje, kterým je například transkripce nebo translace.
Na rozdíl od prokaryot, majících kompletně přepisované tzv. jednoduché geny, se u eukaryot a živočišných DNA-virů setkáváme s geny složenými. Ty jsou charakterizovány nekódujícími a kódujícími úseky DNA - introny a exony. Tyto složené geny jsou pozoruhodné tím, že poskytují přepisem tzv. primární transkript, podléhající posttranskripční úpravě sestřihem. Sestřihem se oddělí nekódující introny od kódujících exonů, které jsou pak spojeny v původní pořadí ve výsledný funkční transkript.
Exprese genu je proces, zahrnující transkripci včetně posttranskripčních úprav, translaci i účast translačního produktu genu na tvorbě nadmolekulárních buněčných struktur a na biologické funkci. Těmito funkcemi se rozumí biokatalysa (enzymy), funkce hormonální (vztah hormon - receptor), funkce transportní (přenos membránami), funkce imunologická (tvorba protilátek) a jiné.
U genu pro RNA zahrnuje pojem exprese genu pouze transkripci včetně posttranskripční úpravy, vedoucí ke vzniku různých typů RNA participujících jednak na přenosu aktivovaných aminokyselin (tRNA) při proteosynthese, jednak na výstavbě ribosomů (rRNA). Regulace genové exprese má na starost regulační oblast genu. Soubor všech genů buňky či viru, zodpovědný za synthesu všech bílkovin buňkou či virem produkovaných, se nazývá genom.
9.2. Deoxyribonukleová kyselina (DNA)
9.2.1. Struktura DNA
Dvojšroubovicová struktura DNA byla navržena Watsonem a Crickem na podkladě zastoupení jednotlivých dusíkatých basí a řady rentgenometrických měření. Strukturní model, založený a vytvořený na předpokladu spojování jednotlivých basí vodíkovými můstky, byl experimentálně potvrzen jako správný. Párováním basí jsou vytvořeny podmínky pro spojení dvou polynukleotidových řetězců, kde geneticky určené pořadí jednotlivých basí jednoho řetězce jednoznačně determinuje pořadí basí v řetězci komplementárním.
Při představě spojení obou polynukleotidových řetězců stočených podél svislé osy získáme schematický model pravotočivé dvojšroubovice DNA.
Zbytky kyseliny fosforečné, spojující molekuly deoxyribosy, tvoří páteř polynukleotidových řetězců vzájemně spojených ve dvojšroubovici vodíkovými můstky. Díky svým záporným nábojům mohou tyto kyseliny fosforečné poutat kladně nabité basické skupiny bílkovin histonů a protaminů a vytvářet tzv. nukleoproteiny. Příkladem takto vzniklých nukleoproteinů je chromatin, přítomný v buněčných chromosomech.
Jak je ze schematu dvojšroubovice patrno, páry basí purin - pyrimidin se nacházejí ve středu molekuly DNA. Toto uspořádání dovoluje plochým povrchům těchto hydrofobních basí (heterocykly jsou v podstatě plochými útvary) skládat se na sebe a omezit tak svůj kontakt s vodou. Dvojšroubovicová bihelikální molekula DNA je za fysiologických podmínek velmi stabilní. I když se tepelným pohybem mohou páry purin - pyrimidin trhat, děje se tak obvykle na konci molekuly DNA, ve středu molekuly zůstávají tuto vazby nedotčeny. Objeví-li se přece trhlina, je záhy likvidována tvorbou týchž vodíkových vazeb za ustálení původní konformace. Je to dáno vysokým počtem slabých vodíkových vazeb uspořádaných tak, že se tyto vazby mohou vzájemně nepřímo ovlivňovat ve snaze udržet původní nativní stav molekuly DNA. Při zvýšení teploty vysoko překračujícím fysiologické podmínky se přirozeně i v případě DNA vodíkové vazby „roztaví“ a poruší se tak původní nativní tvar molekuly. DNA vysokou teplotou denaturuje podobně jako bílkovina.
9.2.2. Replikace DNA
Proces replikace souvisí bezprostředně s přenosem genetické informace uložené v sekvenci nukleotidů DNA. Enzymy, zodpovědné za biosynthesu DNA, vyžadují především předlohu (matrici) pro tuto biosynthesu, dále stavební kameny DNA, tj. trifosfáty všech čtyř potřebných nukleosidů a starter - krátký úsek DNA či RNA.
Předání genetické informace vyžaduje totiž identické zdvojení DNA, tj. její biosynthesu podle přesné předlohy. Tento proces, potvrzený i vizuálně elektronovou mikroskopií, přinesl u fága T7 některá překvapení. Především nepotvrdil předpoklad, že rozpojení původní dvojšroubovice DNA probíhá od konce molekuly DNA do jejího středu. Replikace totiž začíná uvnitř molekuly a to vždy v místě vzdáleném asi 17% od jejího levého konce. Jakmile synthesa DNA začne, pokračuje dál v obou směrech za tvorby „oka“, nabývajícího tvar Y v okamžiku, kdy levá replikační vidlice dojde ke konci dvojšroubovice. Z těchto pozorování bylo zcela jednoznačně vyvozeno, že proces replikace je dvojstupňový. Při něm se musí tzv. rodičovská vlákna nejprve úplně rozvinout a teprve potom mohou působit jako matrice pro tvorbu komplementárních vláken nových dvojšroubovic DNA.
Enzymy účastnící se procesu replikace
Proces replikace je řízen enzymově za přispění dalších, převážně bílkovinných faktorů. Je zahájen rozpletením dvojšroubovice DNA, jehož se účastní specifické rozplétací bílkoviny a enzymy DNA-gyrasa a helikasa. Dalšími enzymy jsou DNA-dependentní DNA-polymerasy zvané též DNA-replikasy, jejichž úkolem je napojování nukleosid-5(-trifosfátu 5(-fosfátem na 3(-OH skupinu koncového nukleotidu rostoucího řetězce. Spojení probíhá za vzniku fosfodiesterové vazby a uvolnění difosfátu. Difosfát se hydrolysuje anorganickou difosfatasou, čímž se vhodně posunuje rovnováha tohoto procesu.
DNA-polymerasy vyžadují k tvorbě nového polynukleotidového řetězce iniciační „očko“, kterým je již hotový oligonukleotid typu DNA či RNA. Ten obsahuje asi 10 nukleotidů a je komplementární k odpovídajícímu úseku DNA. Jeho synthesy se účastní enzym DNA-dependentní polymerasa (primasa).
DNA-polymerasy mohou rovněž uvolnit primer (očko), odštěpovat nukleotidy z konců nově vzniklých DNA řetězců a tím díky své exonukleasové aktivitě i opravovat chyby vzniklé nesprávným zařazením nukleotidu. Dalším enzymem, nezbytným v procesu replikace, je DNA-ligasa (synthetasa). Jejím úkolem je „sešít“ synthetisované úseky DNA v souvislý polynukleotidový řetězec.
Průběh procesu replikace
Replikaci lze rozdělit v podstatě do dvou fází označovaných jako iniciace a prodlužování řetězce DNA. Průběh tohoto procesu, jak byl potvrzen u bakterie Escherichia coli, je uveden schematicky na str 145.
Vlastní proces replikace začíná na tzv. počátečních či iniciačních bodech replikace. Vzhledem k rychlosti jakou replikace probíhá a vzhledem k rozsahu kopírovaných DNA, musí tento proces vycházet současně z více iniciačních bodů. Chromosomy buněk eukaryotů obsahují zhruba tisíc takových iniciačních bodů, z nichž jsou kopírovány úseky DNA délky 12 - 15(m (tzv. replikony).
Replikace je, jak již bylo řečeno, zahájena enzymem gyrasou, katalysujícím despiralisaci nadhelikálních struktur (superhelixu), do kterých je svinuta dvojšroubovice DNA. V následující fázi jsou enzymem helikasou rozvolněny vodíkové vazby dvojšroubovice, spojující protilehlé base komplementárních řetězců.
Na vzniklé replikační vidličce se k jednovláknové DNA naváže protein stabilizující jednovláknové oblasti, které vznikají průběžně v dvojšroubovici DNA během replikačního procesu.
Přestože oba nově synthetisované řetězce jsou, jak je patrno z následujícího obrázku, vzhledem k matricovým řetězcům antiparalelní, probíhá jejich synthesa ve stejném směru. DNA-polymerasa (označovaná jako DNA-polymerasa III)) však katalysuje reakci pouze ve směru 5( ( 3(, tzn. připojuje deoxyribonukleotid 5(- fosfátovou skupinu k 3(- OH konci synthetisovaného řetězce. Aby mohla DNA-polymerasa III tuto reakci uskutečnit současně na obou protilehlých úsecích matricových DNA-řetězců, tedy i na řetězci 3( ( 5(, musí být nejprve na tomto řetězci synthetisovány úseky, poskytující DNA-polymerase III potřebné volné 3(-OH skupiny. Ty vytvoří RNA-polymerasa tvorbou tzv. primerů RNA.
V procesu synthesy nového dceřinného, tzv. zpožďovaného (diskontinuálního ) vlákna (3( ( 5(), jsou napojovány jednotlivé deoxyribonukleotidy v předepsaném pořadí na synthetisované primery za vzniku tzv. Okazakiho fragmentů. Napojování nukleotidů, resp. tvorbu Okazakiho fragmentů, katalysuje DNA-polymerasa III. Po dokončení zmíněných fragmentů se za účasti DNA-polymerasy I odpojí RNA-primery a týž enzym doplní vzniklé mezery deoxyribonukleotidovým řetězcem. Takto vzniklé diskontinuální úseky se potom spojí („sešijí“) fosfodiesterovými vazbami za katalytické účasti DNA-ligasy.
Dceřinné vlákno, (5( ( 3(), synthetisované na druhém matricovém DNA-řetězci, je tvořeno kontinuálně na primeru směrem k vidlici (vlákno vedoucí, předbíhající).
Replikace, jak jsme ji poznali, představuje vznik dvou nových dvojšroubovic DNA, u kterých je jejich jedna část tvořena původním „matčiným“ řetězcem DNA, druhá řetězcem novým, „dceřinným“. Komplementaritou obou částí nově vzniklých dvojšroubovic je zajištěn přesný přenos původního „zápisu“ v DNA do genetické výbavy nové dceřinné buňky. Tento způsob replikace je označován jako tzv. semikonservativní replikace a vše nasvědčuje tomu, že je procesem univerzálním.
Růst dceřinných řetězců probíhá rychlostí asi 103 nukleotidů za minutu. Proces zahájení, vypínání a ovlivňování jeho rychlosti nebyl dosud zcela objasněn.
Průběh procesu replikace
9.2.3. Mutace
Hovoříme-li o mutacích, máme na mysli proměnlivost genetického kódu způ