Biochemie

sobenou změnou původního tripletu basí v DNA. Jestliže mutace postihne malý omezený úsek DNA změnou jednoho nukleotidového páru v dvojšroubovici DNA, jedná se o tzv. bodovou mutaci. Je-li mutací postiženo více nukleotidových párů DNA, jde o mutace rozsáhlejší, charakterizované často rozlomením chromosomů, zesíťováním či dimerisací basí chromosomální DNA. Důsledkem takových změn je chybné čtení při přepisu genetického kódu z DNA do mRNA a následující chyba v překladu z jazyka basí do jazyka synthetisovaných bílkovin. Tento fenomen se pak v synthetisovaném řetězci bílkoviny manifestuje záměnou původně geneticky určených „správných“ aminokyselin za aminokyseliny jiné. To vede ve většině případů ke vzniku zcela nefunkčních bílkovin.
Pokud k těmto záměnám dojde v té části biologicky aktivní bílkoviny, která není bezprostředně za tuto aktivitu zodpovědná, a jestliže navíc má chybně zařazená aminokyselina podobný (hydrofobní či hydrofilní) charakter jako ta, jejíž místo zaujala, nemusí mít tento „omyl“ vážné následky pro příslušnou buňku či organismus. Jestliže se ovšem tímto zásahem výrazně změní charakter či primární struktura funkční bílkoviny, například v aktivním centru některého klíčového enzymu, může mít tato záměna fatální důsledky. Takové mutace na více důležitých místech synthetisovaného bílkovinného řetězce nejsou obvykle slučitelné se životem organismu.
Podobně jako vznikají náhodné chyby při každé sebedokonalejší činnosti či při sebelépe organizovaném procesu, mohou při kopírování genetického kódu nastat nežádoucí omyly chybným zařazením „nesprávného“ nukleotidu při probíhajícím procesu replikace. Příčinou záměny bývá v těchto případech samovolná tautomerace basí resp. přesmyk jejich amino- a oxo-skupin v imino- a enol-formy.
V důsledku těchto tautomerních přesmyků se může při replikaci párovat například adenin s cytosinem místo s thyminem
Dvojšroubovice, vzniklá s tímto chybným párem, se potom dědí dceřinnou buňkou. V dalším replikačním cyklu se řetězec s nesprávně zařazenou basí bude sice párovat normálně, to znamená s guaninem, avšak nově vzniklá dvojšroubovice bude obsahovat pár cytosin-guanin odlišný od původní molekuly DNA, která měla na stejném místě (před tautomerací) pár adenin-thymin.
Četnost takových chyb je však velmi malá (10-5) a navíc bývají tyto chyby ve většině případů odstraňovány sua sponte reparačními procesy v buňce, na kterých mají účast restrikční enzymy typu exonukleas. Ty ještě před zařazením tautomerací pozměněného nukleotidu odstřihnou chybnou basi, čímž se pravděpodobnost spontánních mutací dále výrazně sníží (10-10).
Nejčastějšími příčinami mutací jsou však exogenní faktory, mezi které patří především pronikavé záření a chemické mutageny.
Pronikavé záření vyvolané X-paprsky, gama-zářením nebo zářením ultrafialovým může při delší exposici vyvolat rozsáhlé a nevratné změny na chromosomech, mající obvykle letální charakter.
Některé chemické látky, například dusitany, mohou oxidačně deaminovat adenin, guanin a cytosin za tvorby oxo-analogů těchto basí.
Tato analoga potom vyhledávají při replikaci jiné partnery, což vede k tvorbě nesprávných párů a ve svých důsledcích i k chybám v synthetisovaném peptidovém řetězci.
Jinou látkou podobných vlastností je i hydroxylamin, deaminující cytosin v uracil.
Mutagenní účinky mohou mít i chemicky odlišná analoga basí, jako například 5-bromuracil, strukturou podobný thyminu. Při reduplikaci může být 5-bromuracil omylem pokládán za cytosin, což v konečném efektu vede k záměně adeninu za guanin a tím ke změně sekvence basí v synthetisovaném komplementárním řetězci DNA. Jinými známými chemickými mutageny jsou dusíkatý yperit, epoxidy, akridinová barviva a řada dalších chemických sloučenin. Mechanismus jejich působení se přirozeně liší podle charakteru těchto látek.
Změny ve struktuře DNA se dělí do několika skupin. Do první skupiny se řadí nejběžnější typ mutací tzv. substituce. Při ní se zamění jeden pár nukleotidů některým dříve popsaným způsobem. Pokud dojde k záměně jedné purinové base za druhou purinovou basi (či k vzájemné záměně basí pyrimidinových), nazývá se tento typ substituce transicí. Naproti tomu transverse představuje záměnu base purinové za pyrimidinovou či naopak.
Druhou skupinu mutací představuje delece. Při ní vypadne z řetězce DNA jeden nukleotid, což má za následek změnu pořadí tripletů v další části DNA a tím přirozeně i změnu pořadí aminokyselin v synthetisovaném peptidu. Totéž platí i v případě vypadnutí dvou za sebou následujících nukleotidů. Vypadnou-li stejným způsobem nukleotidy tři, ztratí se pouze jedna aminokyselina a v synthetisovaném peptidu se další primární struktura nezmění.
Inserce, představující třetí skupinu mutací, znamená naproti tomu vsunutí jednoho, případně více nadbytečných článků do molekuly DNA. Těmito články mohou být např. akridinová barviva, strukturou (plochým tvarem molekuly) podobná dusíkatým basím nukleových kyselin. Důsledky této chyby se projeví v synthese peptidu obdobně jako v případě delece.
Mutace nemusí být přirozeně jen důsledkem „nešťastných náhod“ při procesech replikace či transkripce nebo následkem nekontrolovatelných nepříznivých vnějších vlivů. Mutace mohou být vytvářeny i záměrně pro získání nových výkonných kmenů mikroorganismů s výhodnými biotechnologickými vlastnostmi, pro získání výkonných, proti chorobám odolných odrůd zemědělských plodin. Cílenými mutacemi lze vyšlechtit též hospodářská zvířata s vysokými hmotnostními přírůstky, s vhodnější kvalitou masa a podobně. Mutací může být úspěšně využito i v humánní a veterinární medicíně v boji proti zhoubnému bujení, perspektivně i v boji s tzv. genetickými chorobami.
Získávání jedinců s uváděnými výjimečnými vlastnostmi lze dosahovat přenosem určitých vybraných genů v podobě isolované DNA do recipientní buňky. Přenos může probíhat buď rekombinací fragmentů DNA tzv. transformací, či pomocí vektorů, což jsou v podstatě různé typy mimochromosomální DNA. V těchto případech jde o vložení cizorodé DNA do klonovacího vektoru a pomnožení této rekombinantní DNA ve vhodné, nejčastěji bakteriální buňce. Tak lze například užitím mikroorganismů synthetisovat levně a v dostatečném množství významné lidské či zvířecí peptidy nebo bílkoviny jako je lidský insulin, lidský i zvířecí růstový hormon aj. Podrobněji bude o této problematice, zahrnované pod pojem genového inženýrství, pojednáno v předmětu Genetika.
9.3. Ribonukleové kyseliny
9.3.1. Struktura RNA
Jak již bylo řečeno dříve, je chemická stavba RNA podobná stavbě DNA s tím rozdílem, že RNA obsahuje ribosu namísto deoxyribosy a uracil místo thyminu. Jednotlivé typy RNA se vzájemně liší zastoupením basí (některé netypické base tRNA), životností a molekulovou hmotností. Molekulová hmotnost messenger RNA (matriční či informační RNA - mRNA), jejíž životnost je poměrně krátká, se podle původu i určení značně liší v rozmezí 1 až 15 x 105. Ribosomální RNA (rRNA), tvořící spolu s proteinem vysokomolekulární složku proteolytického aparátu (ribosomů), má relativní molekulovou hmotnost řádově srovnatelnou s molekulovými hmotnostmi mRNA( její životnost je však delší. Transportní RNA (tRNA) je nejmenší z těchto tří základních typů ribonukleových kyselin. Skládá se ze 70 až 100 nukleotidů a má relativní molekulovou hmotnost 2,5 až 3,0 x 104.
Molekuly všech typů ribonukleových kyselin existují většinou ve formě jediného polyribonukleotidového vlákna, schopného za určitých podmínek tvořit vodíkové můstky a umožňovat tak vznik potřebné prostorové struktury RNA. Složitější prostorovou strukturu, jako důsledek tvorby zmíněných vodíkových vazeb, vykazuje především RNA transportující aktivované aminokyseliny do místa proteosynthesy (tRNA) a RNA podílející se na výstavbě ribosomů (rRNA).
9.3.2. Transkripce
Všechny typy RNA obsažené v buňce mají společný původ. Všechny jsou synthetisovány podle předlohy, kterou je jedno z vláken dvojšroubovice DNA, nazývané vlákno kodogenní. Na tomto kodogenním vlákně vzniká za účasti RNA-polymeras a potřebných nukleosidtrifosfátů řetězec nukleotidů vzájemně pospojovaných fosfodiesterovými vazbami. Tento proces přepisu genetické informace z DNA do komplementární RNA se nazývá transkripcí.
I když jsou procesem transkripce přepisovány všechny typy RNA, má přepis mRNA v určitém směru výjimečné postavení. Tato RNA je totiž pracovní kopií strukturního genu, která rozhoduje o složení bílkoviny zakódované v přepisovaném úseku DNA. Prostřednictvím mRNA je tato informace přenášena jadernou membránou do cytoplasmy, kde za účasti ribosomů probíhá vlastní proteosynthesa.
Transkripcí vzniklé RNA eukaryotů však nemají definitivní funkční podobu. Jsou pouze prekursory funkčních RNA a musí být jako tzv. primární transkript podrobeny posttranskripčním úpravám.
Enzymy účastnící se procesu transkripce
Procesu transkripce se účastní DNA-dependentní RNA-polymerasa, vyžadující nezbytné nukleotidy a kodogenní (přepisované) vlákno DNA.
Transkripce genů DNA u eukaryotů je katalysována celkem třemi odlišnými typy RNA-polymeras, z nichž každá zodpovídá za biosynthesu funkčně odlišného typu prekursorové RNA, upraveného dodatečně posttranskripčním sestřihem.
RNA-polymerasa I katalysuje synthesu pre-rRNA, RNA-polymerasa II katalysuje synthesu pre-mRNA, RNA-polymerasa III se účastní tvorby pre-tRNA i řady menších jaderných a mimojaderných RNA, jejichž funkce nejsou zatím ještě zcela objasněny. Tyto eukaryotní RNA-polymerasy jsou mnohosložkovými enzymy, obsahujícími 10 až 15 polypeptidových řetězců s širokým intervalem molekulových hmotností. Funkce jednotlivých polypeptidových řetězců nejsou dosud detailně známy, ačkoliv je známa lokalizace jednotlivých polymeras.
U buněk prokaryotů je situace podstatně jednodušší, neboť synthesa všech druhů RNA je katalysována pouze jedinou RNA-polymerasou.
Posttranskripčních úprav ribonukleových kyselin, resp. jejich prekursorů, se účastní enzymy zvané endonukleasy a ligasy, mající schopnost i vnitřně štěpit prekursory RNA a spojovat funkčně aktivní segmenty těchto nukleových kyselin v jeden celek.
Tzv. RNA-viry disponují schopností vytvářet komplementární vlákno DNA na matrici, kterou představuje vlákno RNA. Tohoto, možno říci „obráceného“ procesu transkripce, se účastní enzymy zvané reversní transkriptasy. Bude o nich podrobněji pojednáno v kapitole zabývající se biochemií virů.
Mechanismus procesu transkripce byl podrobně prostudován a objasněn u bakteriálních buněk Escherichia coli a, jak výsledky výzkumu ukazují, je do značné míry podobný procesu u vývojově vyšších a tudíž i složitějších buněk eukaryotních. Pro snadnější pochopení transkripce si proto všimneme jejího průběhu u zmíněné bakterie.
RNA-polymerasa coli bakterií má ve srovnání s polymerasami eukaryotů jednodušší podjednotkovou strukturu, skládající se z 5 odlišných polypeptidových řetězců. Řetězec označený ( není s tzv. enzymovým jádrem pevně spojen a může od něho snadno disociovat. Nemá žádnou vlastní katalytickou funkci a jeho úloha spočívá především v rozpoznání určitých iniciačních signálů v molekule DNA. Speciální terminační signály, končící synthesu RNA, jsou naopak rozpoznávány bílkovinou označovanou (.
Průběh transkripce, znázorněný na následujícím obrázku, probíhá za účasti uvedeného enzymu takto:
Po počátečním navázání RNA-polymerasy na tzv. rekogniční místo (dané sekvencí nukleotidů), se polymerasa posune blíže ke startu transkripce, kde se vytvoří pevná vazba enzymu s tzv. vazebným místem. Synthesa RNA však nestartuje v této stabilní vazebné oblasti, nýbrž asi o 6 až 7 nukleotidů dále. V tomto místě se rozevře dvojšroubovice DNA a od počátečního nukleotidu, obsahujícího vždy purinovou basi, začne proces elongace RNA-řetězce.
Po vytvoření krátkého řetězce RNA se odpojí polypeptidový řetězec ( od enzymového jádra polymerasy, aby byl umožněn pohyb enzymu po DNA. Řetězec RNA roste a odvíjí se ve směru 5( ( 3( rychlostí 50 nukleotidů za sekundu tak dlouho, až enzym dosáhne terminačního signálu. Tento terminační signál, daný terminační sekvencí basí, je čten buď samotnou RNA-polymerasou, nebo v přítomnosti oligomerní bílkoviny (. Zda se tato bílkovina váže přímo na DNA či na RNA-polymerasu není dosud spolehlivě známo.
Předpokládá se, že tato oligomerní bílkovina, rozpoznávající určité sekvence DNA, se po vazbě na tyto sekvence začne pohybovat po matrici DNA proti RNA-polymerase. Po výrazné změně konformace tato bílkovina zastaví polymerasu v terminačním místě a vyvolá následný rozpad komplexu enzym - mRNA - DNA za vzniku synthetisované mRNA, uvolnění bílkoviny (, kodogenního vlákna DNA a RNA-polymerasy.
Průběh synthesy RNA
9.3.3. Osudy a význam synthetisovaných ribonukleových kyselin (posttranskripční úpravy)
Cytoplasmová mRNA eukaryotních buněk je na rozdíl od prokaryotní mRNA produktem posttrankripčních úprav prekursorové mediátorové ribonukleové kyseliny (pre-mRNA). Tato ribonukleová kyselina, vzniklá p