Biochemie

vznikají v dýchacím (respiračním) řetězci mitochondrií dvě molekuly ATP. Jestliže je přenos zprostředkován malátem, může být energetický zisk ještě větší (3 ATP). Přenos protonů mitochondriální membránou je v tomto případě složitější, neboť je do něho zapojen aspartát, glutamát a jeho oxoanalog, jejichž transport membránou je zprostředkován příslušnými přenašeči. Transport protonů za účasti malátu je znázorněn velmi zjednodušeně v druhé části následujícího schematu.
Zprostředkovaný přenos protonů mitochondriální membránou
8.4.1.2. Regulace glykolysy
Průběh glykolysy je citlivě regulován na několika úrovních podle momentálních potřeb organismu. Hlavním regulačním mechanismem je nabídka kyslíku.
Za aerobiosy je proton z NADH, vzniklého dehydrogenací glyceraldehydu, přednostně přenášen do mitochondrií místo na pyruvát. Zde jsou protony spolu s elektrony prostřednictvím respiračních řetězců přeneseny na kyslík za tvorby molekul vody a ATP. Současně se přestává tvořit laktát.
Vysoké hladiny ATP výrazně inhibují klíčový enzym glykolysy fosfofruktokinasu. Modifikace enzymové aktivity fosfofruktokinasy se plynule mění v závislosti na měnícím se poměru ATP/ADP, což ve svém důsledku ovlivňuje celý proces glykolysy. Vysoká nabídka ATP reguluje glykolysu i nepřímo tím, že inhibuje degradaci glykogenu. To vede ke snížení hladiny glukosy a zpomalení její degradace glykolytickým procesem. Současně působí nadbytek ATP stimulačně na biosynthesu glykogenu, který se tak stává depositem energie.
Zmíněný klíčový enzym glykolysy je rovněž allostericky inhibován vysokými hladinami citrátu produkovaného v průběhu citrátového cyklu.
Rostlinná fosfofruktokinasa reaguje velmi citlivě na koncentraci fosfoenolpyruvátu. Tato inhibice fosfoenolpyruvátem závisí zároveň i na koncentraci ATP, který má podobný brzdící účinek. Zajímavé je zjištění, že nižší koncentrace ATP a fosfoenolpyruvátu mohou fosfofruktokinasu v rostlinách naopak stimulovat.
Regulační vlastnosti má u rostlin i poslední enzym glykolysy pyruvátkinasa. Vysoké hladiny ATP a citrátu aktivitu pyruvátkinasy potlačují, zatímco vysoké koncentrace hořečnatých iontů a anorganického fosfátu ji naopak stimulují. V důsledku snížení aktivity pyruvátkinasy se pak mohou hromadit meziprodukty glykolysy včetně fosfoenolpyruvátu, který, jak již bylo řečeno, negativně ovlivňuje aktivitu fosfofruktokinasy.
Glykolysa může být efektivně řízena podle potřeb organismu i rozdílným zastoupením isoenzymů laktátdehydrogenasy ve tkáních. Tak například v kosterním svalstvu a embryonálních tkáních fungujících při nedostatečném přísunu kyslíku se uplatňují isoenzymy s větší afinitou k pyruvátu nežli k mitochondriálnímu systému. Touto regulací je umožňován průběh glykolysy a s tím spojená tvorba ATP v těchto tkáních.
8.4.1.3. Energetická bilance anaerobního odbourávání glukosy (glykolysy)
Vyjdeme-li z nefosforylované glukosy, je k průběhu glykolysy zapotřebí celkem dvou molekul ATP. Jedna k fosforylaci glukosy na glukosa-6-fosfát (reakce 1), druhá k fosforylaci fruktosa-6-fosfátu na fruktosa-1,6-bisfosfát (reakce 4). Tyto spotřebované molekuly ATP musíme tedy v celkové bilanci odečíst jako ztrátové.
Z reakcí na str. 74 je zřejmé, že při hydrolyse 1,3-bisfosfoglycerátu (reakce 7) a fosfoenolpyruvátu (reakce 10) vznikají sumárně dvě molekuly ATP. Protože z jedné molekuly glukosy vznikají vždy dvě molekuly těchto tříuhlíkatých sloučenin, je zisk ATP z jejich hydrolysy dvojnásobný, tj. čtyři ATP.
Celková energetická bilance při degradaci jedné nefosforylované glukosy bude tedy za anaerobních podmínek 4ATP ( 2ATP ( 2ATP .
Vstoupí-li do procesu glykolysy glukosa již fosforylovaná, pocházející například z fosforolysy glykogenu, bude energetický zisk o jednu molekulu ATP vyšší (3ATP). Tento vyšší energetický efekt je ovšem pouze zdánlivý, neboť k získání této třetí makroergní sloučeniny bylo zapotřebí až dvou makroergních sloučenin, jejichž energie byla „ztracena“ při zabudování glukosy do glykogenu.Výhoda je pouze v tom, že zisk třetí molekuly ATP přichází pohotově v době zvýšené poptávky po energii.
V porovnání s aerobními podmínkami odbourávání glukosy se zdá být energetický zisk při anaerobiose malý, ale pro anaerobní mikroorganismy či embryonální tkáň zcela postačuje ke krytí nutných energetických potřeb. Důležitou úlohu má anaerobní proces degradace glukosy u vyšších živočichů i při zásobování kosterního svalstva energií.
8.5. Citrátový cyklus (cyklus trikarboxylových kyselin)
Citrátový (také Krebsův) cyklus představuje u aerobů univerzální cyklický proces, při kterém je za přítomnosti kyslíku glukosa oxidována až na oxid uhličitý. Výsledným efektem této metabolické dráhy je energetický zisk, reprezentovaný redukovanými koenzymy NAD, FAD a makroergními ATP.
Průběh tohoto stěžejního metabolického cyklu navrhl již v roce 1937 Hans Krebs, jeho průběh však byl detailně osvětlen až na základě prací dalších pracovníků v letech pozdějších. Výzkum tohoto procesu byl dovršen v konečné fázi zjištěním, že acetylkoenzymA je oním intermediátem, který poskytuje spolu s oxalacetátem citrát (Ochoa a Linen,1951).
Význam citrátového cyklu je v podstatě dvojí:
Cyklus je významným producentem vodíků odebraných kofaktory oxidoreduktas oxidovanému acetátu (resp. acetylkoenzymuA). Tyto vodíky poskytují oxidací energii pro tvorbu ATP, univerzální „energetické jednotky“, využitelné k saturaci energetických potřeb organismu. Odpadem je CO2, který je vedle vody hlavním konečným produktem oxidace živin.
Meziprodukty tohoto cyklu vytvářejí hotovost pro některé boční metabolické pochody, kterými jsou například synthesa glukosy, lipidů, porfyrinů, především však aminokyselin a bílkovin. Meziprodukty citrátového cyklu mohou být v případě potřeby snadno doplňovány řadou katabolických reakcí, jmenovitě z oblasti degradace aminokyselin (oxoglutarát, oxalacetát aj.). U rostlin a mikroorganismů též o meziprodukty anaplerotického procesu - glyoxylátového cyklu (str. 85).
Z výše uvedených charakteristik vyplývá, že citrátový cyklus je významnou křižovatkou metabolických cest aerobů jak po stránce energetického zisku, tak i po stránce hotovosti společných meziproduktů. Vzhledem k důležitosti této metabolické dráhy, zvláště z hlediska již zmíněného energetického zisku, je celý proces situován v buněčných „elektrárnách“, kterými jsou mitochondrie. Většina enzymů nezbytných pro průběh citrátového cyklu je volně rozptýlena v základní tekuté hmotě mitochondrií - v matrix. Výjimku tvoří pouze sukcinátdehydrogenasa, která je pevně vázána na vnitřní mitochondriální membráně.
8.5.1. Průběh citrátového cyklu
Má-li být pyruvát vzniklý glykolysou totálně oxidován na oxid uhličitý za energetického zisku uloženého v molekulách ATP, musí být nejprve přeměněn na acetát, respektive acetylkoenzymA. Vznik acetylkoenzymuA z pyruvátu je poměrně složitou reakcí zprostředkovanou multienzymovým komplexem pyruvátdehydrogenasy. Je to supermolekula s molekulovou hmotností řádově 106 mající tvar krychle, dobře pozorovatelná v elektronovém mikroskopu. Je spolu s enzymy citrátového cyklu součástí matrix mitochondrie.
Kofaktory tohoto komplexu, tvořeného třemi enzymy, jsou thiamindifosfát, FAD, NAD+, lipoamid a koenzymA. Prostřednictvím tohoto komplexu je pyruvát oxidačně dekarboxylován na acetát, který je přenesen na koenzymA.
Reakce využívající synthesovaný acetylkoenzymA je vlastně první reakcí citrátového cyklu. Regulační allosterický enzym citrátsynthasa (patřící do třídy lyas) katalysuje kondenzaci oxalacetátu (oxosukcinátu) s acetylkoenzymemA na citrát. Reakce je silně exergonní a probíhá prakticky ireversibilně. Její mechanismus lze vysvětlit adicí snadno disociovatelného protonu methylové skupiny acetylkoenzymuA na polarizovanou oxoskupinu oxalacetátu (aldolová kondenzace). Adice je provázena hydrolysou thioesterové vazby a odštěpením koenzymuA (reakce 1).
Aby mohl být vzniklý reakční produkt oxidován, musí se přeměnit obtížně oxidovatelná terciární hydroxylová skupina na snadno oxidovatelnou sekundární skupinu. Potřebný „přesun“ hydroxyskupiny obstará enzym akonitáthydratasa. Průběh reakce si lze pro snadnější pochopení představit jako odštěpení molekuly vody z citrátu a její rehydrataci (zpětnou adici) na cis-akonitát, tentokrát díky stereospecifitě enzymu proti Markovnikovu pravidlu. Výsledkem je vznik isocitrátu, majícího požadovanou oxidace schopnou strukturu (reakce 2).
Isocitrát je v další reakci citrátového cyklu isocitrátdehydrogenasou degradován na 2-oxoglutarát (reakce 3).
V mitochondriích byly nalezeny dva typy isocitrátdehydrogenas. První z nich, spolupracující s NAD+ a vyžadující přítomnost Mg2+ nebo Mn2+, se uplatňuje při nedostatku ATP a zvýšené nabídce NAD+. Slouží při odbourávání acetylkoenzymuA, na jehož úkor má být saturována energetická potřeba organismu. Druhá isocitrátdehydrogenasa, spolupracující s NADP+, je inhibována ATP a NADPH. Uplatňuje se tehdy, jestliže je zvýšená poptávka po reducentech NADPH potřebných k synthetickým reakcím za eventuální účasti meziproduktů citrátového cyklu.
Následující reakce je obdobná přeměně pyruvátu v acetylkoenzymA. Je katalysována multienzymovým komplexem 2-oxoglutarátdehydrogenasy a má analogický průběh. Jejím produktem je sukcinylkoenzymA( vzniká další molekula NADH (reakce 4).
Vzniklý sukcinylkoenzymA je hydrolyticky štěpen na sukcinát a část energie uvolněné štěpením thioesteru enzymem sukcinylkoenzymA-synthetasou se „vtělí“ do molekuly GTP. Enzym nukleosiddifosfátkinasa potom přenese anorganický fosfát z GTP na ATP, takže výsledkem této mezinukleotidové transakce je molekula univerzálního „energetického přenašeče“ ATP (substrátová fosforylace) (reakce 5).
Další reakcí je sukcinát reversibilně dehydrogenován na fumarát (trans isomer butendiové kyseliny). Dehydrogenace je katalysována enzymem sukcinátdehydrogenasou, majícím jako prostetickou složku FAD (reakce 6).
Následuje hydratace dvojné vazby fumarátu katalysovaná fumaráthydratasou. Z reakce resultuje malát (reakce 7).
Vzniklý malát podléhá dehydrogenaci katalysované malátdehydrogenasou. Výsledkem je oxalacetát, který citrátový cyklus uzavírá. Tato závěrečná reakce cyklu je silně endergonní s rovnováhou posunutou v neprospěch oxalacetátu( Její průběh však jde požadovaným směrem v důsledku odčerpávání redukovaného NADH i oxalacetátu dalšími reakcemi (tvorba citrátu, tvorba aspartátu) (reakce 8).
8.5.2. Regulace citrátového cyklu
Průběh citrátového cyklu je velmi citlivě regulován okamžitými požadavky organismu. Vzhledem k tomu, že hlavním úkolem citrátového cyklu je umožnit energetický zisk, bude poměr ATP : ADP : AMP v tzv. adenylátové hotovosti jedním z hlavních regulátorů tohoto procesu. Vysoká hladina ATP, která signalizuje dostatek energie, bude retardovat průběh některých reakcí, jmenovitě aktivaci pyruvátdehydrogenasového komplexu, aktivitu citrátsynthasy a isocitrátdehydrogenasy. Podobně se bude uplatňovat i hladina kyslíku a vzájemný poměr NAD+ a NADH. Také ionty Ca2+ hrají důležitou roli v regulaci citrátového cyklu. Aktivují nepřímo pyruvátdehydrogenasový komplex ve směru produkce acetylkoenzymuA, aktivují isocitrátdehydrogenasu a 2-oxoglutarátdehydrogenasu.
Svou regulační funkci může uplatnit i nabídka či odčerpávání meziproduktů citrátového cyklu související s napojenými vedlejšími metabolickými drahami. Jde hlavně o přísun acetylkoenzymuA, ale též oxoglutarátu a oxalacetátu jako důsledek tzv. anaplerotických reakcí (především karboxylace pyruvátu na oxalacetát).
8.5.3. Dýchací (respirační) řetězec a aerobní fosforylace
V předchozích kapitolách jsme konstatovali, že energie uvolněná oxidací (dehydrogenací) substrátů je ukládána jednak do molekul nukleosidtrifosfátů (především ATP), jednak do redukovaných kofaktorů NAD+, NADP+ a FAD. Zatímco reducenty NADPH jsou spotřebovávány ke specifickým redukcím, je otázka, jakým způsobem je využívána energie uložená v reducentech NADH a FADH2.
Aby byl proces oxidace substrátů doveden do konce, musí vodíky těchto substrátů zreagovat s kyslíkem za vzniku energeticky nejchudší sloučeniny těchto prvků, za vzniku vody. Z obecné chemie víme, že slučování vodíku s kyslíkem je silně exergonní resp. exothermní děj provázený explosivním uvolněním energie. Veškerá uvolněná energie se v tomto případě mění v teplo a objemovou práci vykonanou vůči okolí. Je evidentní, že k takovéto vzájemné interakci molekul vodíku a kyslíku v organismu docházet nemůže.
Má-li být energie vodíků a elektronů přenesených na kyslík pro organismus účelně využita, musí probíhat nikoliv spontánně, nýbrž přes řadu dílčích exergonních pochodů za současného uvolňování ekvivalentních množství energie. Některé z těchto dílčích pochodů mohou, díky postačující exergonitě, sloužit k synthese energeticky bohatého ATP z ADP a anorganického fosfátu. Pouze relativně malé množství energie, uvolněné kaskádovitě uspořádanými dílčími procesy, se změní v teplo( její převážná část se cestou aerobní fosforylace „vtělí“ do molekul ATP. Stupňovitého přenosu vodíku na kyslík je dosaženo dílčími transporty protonů a elektronů od jednoho akceptoru k druhému podle stoupajících oxidoredukčních potenciálů. Každý následný článek je v tomto řetězovém systému (dýchacím řetězci), redukován článkem předešlým.
Tento dýchací řetězec kontinuálně odčerpává vodíky odebrané oxidovaným substrátům a redukuje jimi kyslík přiváděný do tkání. Situován je v mitochondriích, přesněji řečeno ve vnitřních mitochondriálních membránách, v těsné návaznosti na citrátový cyklus a β-oxidaci mastných kyselin, které jsou přednostními dodavateli vodíků odebraných substrátům během dehydrogenací.
Schéma dýchacího řetězce
K vysvětlení mechanismu ukládání energie do molekul ATP při přenosu protonů a elektronů oxidačním řetězcem byly vytvořeny dvě hypotézy.
První je hypotéza chemická (chemického spřažení). Ta předpokládá tvorbu energeticky bohatého meziproduktu na třech místech respiračního řetězce. Tento hypothetický energeticky bohatý meziprodukt, tvořený částí redoxního systému a tzv. spojovacím faktorem (Sa ( X), přenáší energii na enzym, katalysující synthesu ATP z ADP a anorganického fosfátu. Jeden článek (jedno místo) tohoto řetězce, produkujícího ATP, je uveden na následujícím obrázku.
Chemická hypotéza vzniku ATP
Popisovaný průběh tvorby ATP prostřednictvím energeticky bohatého meziproduktu se přes veškerou snahu nepodařilo potvrdit. Nebyl nikdy isolován ani postulovaný makroergní meziprodukt, ani nebylo možno vysvětlit nezbytnost úzkého spojení dýchacího řetězce a aerobní fosforylace s neporušenou mitochondriální membránovou strukturou, nutnou pro vznik molekul ATP.
Dnes je obecně přijímána druhá hypotéza, hypotéza chemiosmotická (Mitchell 1961), podložená několika experimentálními důkazy. Touto, dnes již možno říci teorií, je vysvětlována i tvorba ATP ve světelné fázi fotosynthesy. Teorie vychází ze známého již rozložení multienzymového komplexu v mitochondriální membráně, jehož součástí je i enzym ATP-asa (ATP-synthasa), zodpovědný za synthesu i štěpení ATP.
Podstata chemiosmotické teorie spočívá v tom, že atomy vodíku odňaté substrátu dehydrogenasami jsou účinkem enzymů dýchacího řetězce (které jsou součástí mitochondriální membrány) rozloženy na H+ a elektron. Zatímco elektrony jsou transportovány nehemovým železem a soustavou cytochromů v membráně až na kyslík který redukují, protony jsou přenášeny NAD+, flaviny a koenzymem Q (ubichinonem) z matrix mitochondrie do mezimembránového prostoru. Přenos elektronů a protonů je současně provázen konformačními změnami jednotlivých enzymů. Tak vzniká koncentrační gradient protonů - tzv. protonmotivní síla. Tato protonmotivní síla, skládající se z membránového potenciálu (klidový potenciál membrány) a ze změny koncentrace vodíkových iontů (( pH) na obou stranách vnitřní mitochondriální membrány, vytváří protonový gradient, který je zdrojem energie pro synthesu ATP( integruje reakce dýchacího řetězce s fosforylací ADP anorganickým fosfátem.
Takto „nahromaděné“ protony na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány potom difundují kanálkem v integrální bílkovině enzymového komplexu ATP-asy (označené v následujícím obrázku F0) po koncentračním spádu zpět do matrix mitochondrie. Na této cestě se dostávají do kontaktu s katalytickou složkou zmíněného enzymu (F1), čnící do nitra matrix mitochondrie. Na této katalytické složce probíhá reakce ADP s anorganickým fosfátem za vzniku ATP.
Podle Mitchellovy teorie dochází ke vzniku ATP tak, že se ADP i anorganický fosfát společně vážou na povrch katalytické složky. Účinkem protonů je z fosfátu za katalytického působení enzymu odštěpen kyslík (O2-), který s 2H+ poskytne molekulu vody. V následující fázi potom volná valence fosfátu relativně snadno zreaguje s molekulou ADP a vzniklý ATP se uvolní z vazby na povrchu katalytické složky F1. Popsaný proces synthesy ATP je provázen konformačními změnami této katalytické složky.
Důkazem, že dýchací řetězec je spřažen s fosforylací prostřednictvím gradientu (protonmotivní síly) je to, že
umělým vytvořením gradientu pH na vnitřní mitochondriální membráně dochází k synthese ATP bez toku elektronů membránou
látky, které přenášejí protony membránou, tzn. ruší membránový potenciál (např. 2,4-dinitrofenol), odpřahují fosforylaci od toku elektronů a blokují synthesu ATP.
Přenos dvou protonů mitochondriální membránou představuje energii postačující k tvorbě jedné molekuly ATP. Jsou-li předány respiračními řetězci protony a elektrony prostřednictvím NAD+, vzniknou přenosem tří dvojic protonů tři molekuly ATP. Při oxidaci substrátů flavinovými enzymy jsou mitochondriální membránou transportovány pouze 2 x 2H+, což je provázeno tvorbou dvou molekul ATP.
Schéma dýchacího řetězce a jeho funkce
V eukaryotních buňkách je většina ATP utilisována v cytoplasmě, zatímco produkovaná je na vnitřní mitochondriální membráně a uvolňována je do matrix mitochondrie. Vzhledem k tomu, že vnitřní mitochondriální membrána je pro nukleotidy nepropustná, musí existovat způsob, jak převést ATP z mitochondrie do cytoplasmy. Tento transport je realizován prostřednictvím enzymu translokasy, který je součástí komplexu mitochondriální ATP-asy. Tato integrální enzymová bílkovina, vlastnící vazebná místa pro ATP i ADP, přenáší oba nukleotidy v přesném molárním poměru 1 : 1 rychlostí, řídící se poměrem koncentrací ATP ( ADP + Pi v cytoplasmě. Tímto mechanismem je umožněn vstup ADP do mitochondrie a jeho následná fosforylace provázená současným výstupem ATP z mitochondrie do cytosolu.
Regulace aerobní fosforylace se řídí spotřebou ATP mimo mitochondrii. Jestliže je poměr ATP : ADP : AMP měněn v neprospěch ATP, je to signálem pro tvorbu tohoto nukleotidu. Regulace synthesy ATP je uskutečňována působením allosterických enzymů, regulovaných okamžitým poměrem všech tří výše uvedených nukleotidů.
8.5.4. Energetická bilance aerobního a anaerobního odbourávání glukosy
Znalost dýchacího řetězce a s ním spojeného procesu aerobní fosforylace nám nyní umožňuje poznat celkovou energetickou bilanci úplné oxidace glukosy.
Vyjdeme-li z nefosforylované glukosy, je energetický zisk oxidace jedné molekuly tohoto monosacharidu na úroveň pyruvátu 2 ATP a dvě molekuly NADH. Za aerobních podmínek jsou tyto redukované koenzymy využity v dýchacím řetězci k tvorbě ATP, zatímco pyruvát je dále oxidován v citrátovém cyklu až na oxid uhličitý.
Jak již víme, je tvorba acetylkoenzymuA z pyruvátu provázena vznikem jedné molekuly NADH. Průběhem reakcí citrátového cyklu se získají při oxidaci molekuly acetylkoenzymuA tři molekuly NADH, jedna molekula FADH2 a jedna molekula ATP, vzniklá zprostředkovaně přes GTP. Všechny redukované koenzymy odevzdají vodíky v dýchacím řetězci za tvorby molekul ATP.
Shrňme nyní celý proces oxidace jedné molekuly glukosy v přehlednou energetickou bilanci:
průběh glykolysy až po dvě molekuly pyruvátu 2 ATP
2 NADH + H+ 6(4) ATP (viz str. 76)
přeměna dvou molek