Biochemie

tulosa-7-fosfát, R5P = ribosa-5-fosfát, Ru5P = ribulosa-5-fosfát.
Celkově lze vyjádřit Calvinův cyklus rovnicí :
6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + 18 ATP + 12 H2O = C6H12O6 + 12 NADP+ +18 ADP + 18 Pi
Je zřejmé, že k tvorbě hexosy (glukosy) musí proběhnout cyklus šestkrát. Ze schematického přehledu reakcí odpovídajících asimilaci CO2 lze odvodit, že 5/6 vytvořených triosafosfátů se musí použít k regeneraci ribulosa-5-fosfátu. Z toho vyplývá, že jedna C6 sloučenina je výsledným výtěžkem asimilace CO2.

Postavení Calvinova cyklu v metabolismu je velmi významné. V chloroplastech vyrobený hexosafosfát se použije pro synthesu polysacharidů. Část triosafosfátů opouští chloroplasty, v cytoplasmě jsou využity enzymy glykolysy, nebo přes glukosu a fruktosu se tvoří sacharosa a celulosa. Pyruvát z glykolysy se může měnit na acetylCoA a z něho pak může vycházet synthesa mastných kyselin a isoprenoidů.
8.1.3 Hatschův a Slackův cyklus C4-dikarboxylových kyselin
M. Hatch a C. Slack v roce 1970 objevili, že některé subtropické rostliny (tzv. C4-rostliny) tvoří jako první produkt asimilace oxidu uhličitého čtyřuhlíkaté sloučeniny oxalacetát, malát a další. Tuto vlastnost mají tak významné kulturní plodiny jako jsou kukuřice, cukrová třtina, čirok, bavlník, ale i některé plevele, např. lebeda, laskavec. C4-cyklus byl prokázán u více než 500 druhů rostlin. Význam C4-cyklu spočívá v tom, že zvyšuje účinnost fixace CO2 v lokalitách s vysokou intensitou záření, vysokou teplotou a omezeným přístupem vody. Na plném slunci fixují C4-rostliny CO2 obecně dvakrát rychleji než C3-rostliny.
Oba procesy fixace oxidu uhličitého jsou zde prostorově odděleny v anatomicky odlišných částech listu. V buňkách těsně přiléhajících k cévním svazkům (tzv. pochvy cévních svazků) probíhá Calvinův cyklus. V mezofylových buňkách probíhá C4-cyklus a to tak, že enzym fosfoenolpyruvátkarboxylasa katalysuje fixaci CO2 na fosfoenolpyruvát. Vzniká oxalacelát, který se fotochemicky vytvořeným NADPH redukuje malátdehydrogenasou na malát. Ten jde do buněk pochvy svazků cévních a enzymem malátdehydrogenasou dekarboxylační se štěpí za vzniku oxidu uhličitého a pyruvátu. Oxid uhličitý je spotřebováván v Calvinově cyklu (v buňkách pochev cévních svazků) a pyruvát se vrací zpět do mezofylu a enzymem pyruvátorthofosfátdikinasou se mění na fosfoenolpyruvát a celý cyklus se opakuje.
Oxid uhličitý, fixovaný při C4-cyklu, nemusí být nutně zpracováván v Calvinově cyklu, ale přes malát, aspartát může vstupovat do dalších metabolických pochodů.
Mechanismus fotosynthesy C4-rostlin zabezpečuje vysokou efektivitu fixace oxidu uhličitého a tím i intensivní tvorbu rostlinné biomasy. C4-rostliny se také vyznačují sníženou fotorespirací a poskytují celkově vyšší hodnoty fotosynthetické produkce.
Rostliny z čeledi tučnolistých (Crassulaceae) jsou vybaveny obměnou C4-cyklu aby mohly oddělit hromadění CO2 od jeho zpracování Calvinovým cyklem. Kdyby se otevíraly jejich průduchy ve dne, ztratily by tyto rostliny transpirací neúměrně mnoho vody. Proto se přes noc hromadí produkt fixace CO2 malát, který vzniká z oxalacetátu a ukládá se do vakuol. Ve dne dochází k jeho dekarboxylaci a uvolněný CO2 vstupuje do Calvinova cyklu. Tento cyklus se označuje jako CAM (Crassulacean acid metabolism) cyklus. Mezi CAM patří asi 300 druhů rostlin z 18 rodů.
8.2. Fotorespirace
V thylakoidech vzniká během fotosynthesy v necyklické fosforylaci i kyslík jako jeden z produktů fotolysy vody. O vazebné místo ribulosabisfosfátkarboxylasy se uplatňuje kompetice mezi kyslíkem a oxidem uhličitým. Oxid uhličitý a kyslík jsou tedy soutěžící substráty bifunkčního enzymu. Při vysokém poměru CO2 / O2 pracuje tento enzym jako karboxylasa, při nízkém poměru CO2 / O2 jako oxygenasa (štěpí oxidačně).
Reakce ribulosa-1,5-bisfosfátu s kyslíkem vede ke tvorbě pouze jedné molekuly 3-fosfoglycerátu spolu s tvorbou jedné molekuly fosfoglykolátu. Tyto dvě látky se přenáší z chloroplastu do další buněčné organely peroxisomu, kde 3-fosfoglycerát oxiduje na hydroxypyruvát, který se transaminační reakcí mění na serin. Fosfoglykolát přechází na glyoxylát, který opět transaminací dává další aminokyselinu glycin.
Fotorespirace je z hlediska tvorby biomasy pro rostlinu ztrátová, ale pravděpodobně představuje hlavní cestu pro synthesu glycinu a serinu.
Enzymy fotorespirace :
1. oxygenasa
2. fosfatasa
3. hydroxypyruvátdehydrogenasa
4. glyoxylátreduktasa
5. glykolátoxidasa
transaminasa
8.3. Asimilace dusíku a síry rostlinami
8.3.1.Fixace vzdušného dusíku
Zdrojem dusíku pro biosféru je molekulární forma tohoto prvku (N2) z atmosféry. Molekula dusíku je relativně stabilní a k jejímu zapojení do oběhu dusíkatých látek v živých organismech je nutné ji redukovat na amonné ionty. Tvorba amoniaku z elementárního dusíku je sice pochod exergonní, ale aktivační energie této synthesy je vysoká.
Redukce molekulárního dusíku probíhá u řady prokaryotních organismů (např. půdní bakterie rodů Azotobacter, Clostridium, Klebsiella, ale také sinice z rodu Nostoc).
Nejefektivnější zdroj dusíku jsou bakterie z rodu Rhizobium, které žijí symbioticky v hlízkách na kořenovém systému bobovitých rostlin (Fabaceae). Jejich činnost představuje fixaci 10 - 30 g dusíku /m2 za rok. V kořenových hlízkách se těsně spojují bakteriální buňky, které degenerují na tzv. “bakteroidy“ s buňkami hostitelské rostliny. Bakteroidy produkují enzym nitrogenasu a speciální hemoprotein leghemoglobin, jehož strukturní gen je součástí genomu hostitele. Tato látka váže elementární kyslík a zajišťuje tak anaerobní prostředí, které je předpokladem pro redukci N2. Nitrogenasa se skládá ze dvou komponent. Jedna bílkovina obsahuje železo a druhá bílkovina obsahuje železo a molybden. Obě komponenty nitrogenasy jsou složeny z podjednotek - první ze dvou a druhá ze čtyř podjednotek a obsahují organicky vázanou síru. Schopnost redukovat dusík má pouze enzym vzniklý spojením obou výše uvedených částí.
Redukčním činidlem in vivo je ferredoxin, pocházející z fotosynthesy, přičemž k přenosu jednoho elektronového páru na dusík je zapotřebí „n“ molekul ATP.
N2+6 ferredoxinred(6e-) + nATP + 8H+ 2NH4 ++ 6 ferredoxinox+ nADP+ nPi
n ( 6
Amonné ionty vzniklé redukcí N2 jsou zabudovány do glutaminu a odtud jsou zaváděny do všech dusíkatých látek v rostlinné buňce.
Specifita nitrogenasy je poměrně široká, vedle N2, N2H2 a N2H4 mohou sloužit jako její substráty také acetylen, kyanovodík a dokonce samotný proton.
HC ( CH + 2e- + 2H+ H2C = CH2
HC ( N + 6e- + 6H+ CH4 + NH3
2H+ + 2e- H2
Nevyužitá část toxického amoniaku je oxidována bakteriemi na netoxické nitráty, které představují zásobu dusíku v půdě. Proces přeměny amoniaku na nitráty označujeme jako nitrifikaci a provádějí jej půdní nitrifikační bakterie Nitrobacteraceae.
8.3.2. Asimilace nitrátů
Zelené rostliny a houby přijímají z půdy nitráty, redukují je na amonné ionty a budují z nich všechny buněčné dusíkaté sloučeniny. U obou skupin organismů se nitráty redukují za přenosu 8e- na amonné ionty ve dvou reakcích. Nejprve se redukuje nitrát na nitrit enzymem nitrátreduktasou a ve druhém stupni enzym nitritreduktasa redukuje nitrit na amonné ionty.
Nitrátreduktasa je enzym, který pracuje v cytoplasmě. Obsahuje železo, molybden a vázaný FAD. Redukční činidlo je NADH nebo NADPH pocházející z glykolysy nebo z pentosofosfátového cyklu. Synthesu nitrátreduktasy lze indukovat nitrátem a inhibovat přítomností NH4+.
Nitritreduktasa je aktivní v chloroplastech a souvisí s procesem fotosynthesy. Tomu nasvědčuje i silné kolísání aktivity tohoto enzymu během dne a noci. Donorem elektronů k redukci nitritu na NH4+ je redukovaný ferredoxin.
Celý pochod redukce lze znázornit schematem:
Primární produkty asimilace dusíku jsou kyselina glutamová a glutamin. Inkorporace amoniaku do aminokyselinové hotovosti se děje prostřednictvím systému glutamát/oxoglutarát.
U eukaryotních organismů ovládá vstup dusíku do organických sloučenin glutamátdehydrogenasa, která katalysuje reakci:
V chloroplastech obsažená glutamátdehydrogenasa je vázána na thylakoidy a je závislá na NADPH, kdežto glutamátdehydrogenasa mitochondrií vyžaduje NADH.
Chloroplasty též slouží jako zásobárna dusíku, který je uložen ve formě glutaminu, nutného pro synthesu purinů a aminokyselin.
Reakci katalysuje enzym glutaminsynthetasa, která vykazuje k NH4+ třikrát vyšší afinitu než glutamátdehydrogenasa.
Glutaminsynthetasa by proto mohla mít vedle své úlohy pro asimilaci NH4+ též funkci „detoxikace“ chloroplastů. In vitro amonné ionty způsobují inhibici fotofosforylace.
U prokaryotních organismů inkorporaci amoniaku do aminokyselin vykonává systém dvou enzymů. Působením glutaminsynthetasy vytváří amoniak amidovou skupinu glutaminu, která se stává vlastním donorem aminoskupiny pro FeS - flavoprotein glutamátsynthasu.
Schéma inkorporace amoniaku do aminokyselin u prokaryot (Escherichia coli):
V biosféře probíhá proces denitrifikace při které se nitráty a produkty jejich redukce nepoužívají k výstavbě buněčných struktur, ale jsou po redukci vyloučeny. Denitrifikaci provádějí fakultativně anaerobní organismy. Nitráty přitom přecházejí na NO2-, N2O až na N2. Vznikající N2, (N2O) se vrací do atmosféry.
Koloběh dusíku
8.3.3. Asimilace síry
Síra spolu s dusíkem náleží k prvkům, které jsou nezbytné pro život rostlin a živočichů. Biologicky důležité sirné sloučeniny obsahují síru převážně ve formě sulfidu (-S-). Zdrojem síry pro biochemické sloučeniny je síranový anion, jeho redukce a inkorporace do organických látek probíhá jen u rostlin, bakterií a hub.
Enzymy redukce jsou u rostlin lokalizovány v chloroplastech, u kvasinek v cytoplasmě. Živočichové využívají síru výhradně ve formě organických látek.
Síranový anion (SO42-) se aktivuje dvojí reakcí s ATP. Vzniká tzv. „aktivní sulfát“. A to nejprve přeměnou na smíšený anhydrid adenylylsulfát (adenosylfosfosulfát, APS) působením enzymu sulfátadenylyltransferasy, potom další fosforylací adenylylsulfátkinasou na 3´- fosfoadenylylsulfát (fosfoadenosylfosfosulfát, PAPS):
Před redukcí se sulfát z aktivního sulfátu (PAPS) přenáší na nízkomolekulární bílkovinný nosič, který je součástí komplexu enzymu sulfátreduktasy. Donorem elektronů k redukci sulfátu na sulfid je u rostlin redukovaný ferredoxin, který je produktem fotosynthesy lokalizované v chloroplastech. U kvasinek je redukčním činidlem NADPH.
Prvním meziproduktem s organicky vázanou sírou je aminokyselina cystein (oxidační číslo síry -2). Tento cystein je za účasti homoserinu přes cystathionin převáděn v methionin. Methionin tedy vzniká z cysteinu přes homocystein cystathioninovou cestou:
8.4. Odbourávání glukosy
K průběhu všech fysiologických funkcí, souvisejících se životem buňky, je nezbytný přísun energie. Vyvstává tedy otázka, jak je trvale a plynule zajištěn přísun této energie do „výrobního procesu“ buňky.
V předchozích kapitolách jsme se dozvěděli, že prvotní a energeticky velmi bohatou sloučeninou je molekula glukosy. Můžeme tedy předpokládat, že proces získávání energie u heterotrofů bude probíhat právě cestou „spalování“ této sloučeniny.
Vývojově zřejmě nejstarším způsobem degradace glukosy je glykolysa, představující odbourávání glukosy za nepřítomnosti kyslíku. Ačkoliv je energetický zisk (ve formě ATP) provázející tento proces velmi malý, přesto zcela postačuje ke krytí energetických požadavků organismů, žijících za anaerobních podmínek. Glykolysa, jako způsob získávání energie, má svou důležitost a význam i pro organismy aerobní, například při saturování energetických potřeb tkání vnitřních orgánů vyšších živočichů.
Průběh glykolysy je v organismu citlivě regulován podle okamžité potřeby energie a podle nabídky kyslíku. V přítomnosti kyslíku je štěpení glukosy podstatně hlubší a vede přes pyruvát a citrátový cyklus až k oxidu uhličitému, energeticky nejchudší sloučenině uhlíku. Proces je zároveň provázen vysokým energetickým ziskem uloženým v synthetisovaných molekulách ATP (viz kapitolu Citrátový cyklus).
Kdybychom chtěli dosáhnout stejného energetického zisku jak anaerobním, tak aerobním způsobem štěpení glukosy, stačilo by ve druhém případě relativně velmi malé množství tohoto „paliva“ ve srovnání s jeho potřebou za podmínek anaerobiosy.
8.4.1. Glykolysa (anaerobní odbourávání glukosy)
Proces glykolysy byl prvním detailně prostudovaným metabolickým pochodem, jemuž předcházela dávno známá tvorba ethanolu při zkvašování cukerných roztoků kvasinkami (Pasteur 1854 - 1864). Zjištění, že i bezbuněčný extrakt z kvasinek má schopnost zkvašovat cukerné roztoky, vyvrátilo definitivně do té doby předpokládanou existenci „vis vitalis“ řídící údajně přeměny látek probíhající v organismu. Další zkoumání procesu zkvašování cukrů se proto přesunulo do oblasti chemie, resp. vznikající biochemie (Buchner 1897).
V rámci výzkumu glykolysy učinili A. Harden a W. Young (1905 - 1910) dva důležité objevy:
1. Kvašení vyžaduje přítomnost anorganického fosfátu, který je zabudován do meziproduktu
fruktosa-1,6-bisfosfátu.
Bezbuněčný extrakt lze dialysou rozdělit na podíl nedialysovatelný, termolabilní (později identifikovaný jako směs enzymů) a podíl disociovatelný, termostabilní (směs koenzymů - NAD+, ATP, ADP a kovových iontů).
S použitím inhibujících látek byly postupně identifikovány další hromaděné meziprodukty odbourávání glukosy a tím byl v konečné fázi dešifrován celý proces glykolysy. Bylo zjištěno, že až na malé výjimky, všechny organismy bez ohledu na svou rozmanitost metabolizují glukosu stejným způsobem.
Na základě současných poznatků lze konstatovat, že glykolysa je biochemický proces degradace glukosy, jehož výsledkem je vznik pyruvátu při současné tvorbě molekul ATP. Za anaerobních podmínek je pyruvát nejčastěji odbouráván za tvorby laktátu (mléčné kvašení) nebo ethanolu (alkoholové kvašení).
Za anaerobiosy může pyruvát podléhat i dalším biochemickým přeměnám (str. 75). Za přístupu kyslíku je, jak již bylo řečeno, pyruvát zoxidován až na oxid uhličitý a vodu.
8.4.1.1. Průběh glykolysy
Vlastní průběh glykolytického odbourávání glukosy lze rozdělit do tří fází. V první fázi je glukosa postupně rozštěpena na dvě molekuly fosforylovaných trios - aldotriosu a ketotriosu. Proces je provázen spotřebou dvou molekul ATP na fosforylaci glukosy a fruktosa-6-fosfátu. Následující druhá fáze je charakterizována oxidací vzniklých triosafosfátů na 3-fosfoglycerát a jeho přeměnou na pyruvát. Tato oxidace a následná transformace 3-fosfoglycerátu je provázena uvolněním energie a jejím zachycením a uložením ve čtyřech molekulách ATP. Poslední, třetí fáze, představuje další osud pyruvátu.
Do vlastního procesu glykolysy může vstoupit glukosa pouze ve formě fosforečného esteru. Volná glukosa musí být proto nejprve fosforylací povýšena do vyššího energetického stavu, aby pak mohla být další reakcí akceptována. Enzym, který obstarává tuto fosforylaci, se nazývá hexokinasa. Fosforylace proběhne na šestém uhlíku glukosy za vzniku glukosa-6-fosfátu (Robisonův ester - reakce 1). Glukosa, vzniklá fosforolytickým štěpením glykogenu, má fosfátovou skupinu vázanou v poloze 1 (Coriho ester). Musí být proto před vstupem do procesu glykolysy přeměněna intramolekulární transferasou (fosfoglukomutasou) na požadovaný Robisonův ester (reakce 2).
Vzniklý glukosa-6-fosfát je přeměněn glukosafosfátisomerasou (intramolekulární transferasa) na reaktivnější, energeticky bohatší, furanoidní formu fruktosa-6-fosfátu (Neubergův ester) (reakce 3).
K dalšímu zvýšení reaktivity je fruktosa-6-fosfát enzymem fosfofruktokinasou fosforylován na prvním uhlíku za vzniku fruktosa-1,6-bisfosfátu (Harden-Youngův ester). Tím je usnadněno štěpení vazby mezi třetím a čtvrtým uhlíkem, které vede k decyklizaci fruktosy (reakce 4 a 5).
Fruktosa-1,6-bisfosfát je štěpen enzymem aldolasou za vzniku glyceraldehyd-3-fosfátu a dihydroxyacetonfosfátu. Rovnováha této reakce není příznivá triosám, avšak odčerpávání trios následnými reakcemi umožňuje její obnovování a tudíž štěpení dalších molekul fruktosa-1,6-bisfosfátu (reakce 5).
Rovnováhu mezi oběma triosami, výrazně posunutou ve prospěch dihydroxyacetonfosfátu, udržuje enzym triosafosfátisomerasa (reakce 6).
Protože pro další průběh glykolysy je vyžadován glyceraldehyd-3-fosfát, musí být následná reakce výrazně exergonní, aby „táhla“ obě předchozí reakce potřebným směrem (viz str. 29 kap. Energetické spřažení biochemických reakcí).
Touto reakcí je dehydrogenace hydratované formy glyceraldehyd-3-fosfátu provázená vznikem 3-fosfoglycerátu. Reakce se spoluúčastní i anorganický fosfát, vytvářející acylfosfátovou vazbu v 1,3-bisfosfoglycerátu. Hydrolysou acylfosfátové vazby energeticky bohatého 1,3-bisfosfoglycerátu se uvolněná energie „vtělí“ do molekuly ATP (reakce 7,8).
Vycházíme-li z toho, že z jedné molekuly glukosy vznikají dvě triosy, pak musíme v předchozích rovnicích uvažovat dvě molekuly glyceraldehyd-3-fosfátu podléhající oxidaci. Tak vzniknou na jednu molekulu glukosy dvě molekuly NADH a stejný počet molekul ATP.
V následující reakci přenese enzym fosfoglycerátmutasa fosfát fosfoglycerátu z polohy 3 do polohy 2 za vzniku 2-fosfoglycerátu (reakce 9).
Odštěpením molekuly vody z 2-fosfoglycerátu enzymem enolasou vznikne energeticky bohatý fosfoenolpyruvát (reakce 10).
Hydrolysou fosfoenolpyruvátu enzymem pyruvátkinasou se odštěpí anorganický fosfát a vznikající nestálý enolpyruvát okamžitě tautomeruje na stálejší oxoformu. Reakce je provázena uvolněním energie, postačující k tvorbě molekuly ATP (reakce 11). Vyjdeme-li ze stejné úvahy jako v případě předchozí tvorby ATP (reakce 8), vzniká na jednu molekulu glukosy stejný počet molekul ATP (2 ATP).

Jak je patrno z uvedeného přehledu reakcí glykolysy, probíhá proces štěpení glukosy až k pyruvátu za anaerobních i aerobních podmínek společně. Teprve od tohoto místa se katabolické dráhy rozcházejí v závislosti na nabídce či nedostatku kyslíku.
Souhrnné schéma glykolysy
Za nepřístupu či nedokonalého přístupu kyslíku je pyruvát
redukován za účasti laktátdehydrogenasy, spolupracující s NADH, na laktát. K tomuto procesu dochází mimo jiné ve svalech za zvýšené námahy. Vznikající a hromadící se laktát ve svalech vyvolává mírnou acidosu, manifestující se svalovou únavou a vyčerpáním, provázeným bolestmi hlavy, žaludku a celkovou nevolností.
dekarboxylován za účasti enzymu pyruvátdekarboxylasy na acetaldehyd, který je potom hydrogenován (redukován) alkoholdehydrogenasou spolupracující s NADH na ethylalkohol.
Za anaerobních podmínek a přítomnosti koenzymuA může být některými mikroorganismy pyruvát měněn i na acetylkoenzymA, oxid uhličitý a vodík. Vzniklý acetylkoenzymA, či jeho kondenzační produkt acetoacetylkoenzymA, se potom stávají akceptory vodíkových atomů z NADH, což je provázeno tvorbou acetátu, acetonu, isopropylalkoholu, butanolu, acetolaktátu, acetoinu, případně 2,3-butandiolu (různé typy kvašení).
Za přítomnosti kyslíku je pyruvát zcela oxidován cyklickým sledem reakcí nazývaným citrátový či Krebsův cyklus. Enzymy tohoto oxidačního procesu jsou na rozdíl od enzymů glykolysy situovány v mitchondriích. Odlišná lokalizace enzymů glykolysy a citrátového cyklu však nebrání vzájemné návaznosti těchto metabolických cest, neboť společný meziprodukt - pyruvát - snadno prochází mitochondriální membránou z cytosolu do nitra mitochondrie.
Určité problémy v komunikaci mezi cytosolem a nitrem mitochondrie nastávají při transportu vodíkových atomů z NADH mitochondriální membránou do respiračních řetězců, neboť membrána postrádá transportní protein pro přenos NADH. Proto musí tento redukovaný koenzym, vzniklý při dehydrogenaci glyceraldehyd-3-fosfátu (reakce 7), odevzdat protony do mitochondrií zprostředkovaně. Prostředníkem přenosu vodíkových atomů mitochondriální membránou může být dihydroxyacetonfosfát.
Oxidoredukční dvojice dihydroxyacetonfosfát - glycerolfosfát v tomto případě funguje jako článek předávající vodíkové atomy flavinové dehydrogenase. Prostřednictvím této dehydrogenasy