návody na cvičení

pozorováni a porovnejte.
Fotometrické stanovení fruktosy (resorcinolem)
Princip :
Resorcinol (1,3-benzendiol) poskytuje v kyselém prostředí (HCI) a za zvýšené teploty s fruktosou červený až červenohnědý reakční produkt. Obsah fruktosy se tedy stanoví nepřímo změřením intensity zbarveni tohoto produktu, jehož koncentrace je úměrná kvantu přítomné a zreagované fruktosy.
Potřeby:
0,1 % roztok resorcinolu v ethanolu.
30% HCI (konc. HCI, zředěná vodou v poměru 5:1)
0,02 % roztok fruktosy (standard) - je připraven - odpovídá 0,2 g fruktosy/1 l
destilovaná voda
Pracovní postup:
Do prvních pěti zkumavek odpipetujeme postupně 0,4; 0,8; 1,2; 1,6 a 2 ml standardního roztoku fruktosy. Doplníme na objem 2 ml dest. vodou (tj. 1,6;1,2; 0,8; 0,4 a O ml). Do šesté zkumavky odpipetujeme 2 ml dest. vody. Do sedmé a osmé zkumavky odpipetujeme 2 ml zkoumaného roztoku fruktosy ( zapíšeme si číslo) . Nyní do všech zkumavek přidáme pipetou 2 ml roztoku resorcinolu a válečkem 6 ml HCI. Všechny pečlivě promícháme protřepáním.
Vyhřejeme vodní lázeň na 80 °C a všechny zkumavky (vhodné je řádně označit, aby se nepopletly) do ní vložíme na dobu 15 minut. Po vyjmutí je necháme cca 15 minut chladnout a proměřujeme ve SPECOLu při 490 nm. Při tom nám šestá zkumavka slouží jako slepý pokus, proti kterému ostatní proměřujeme.
Z hodnot absorbance první až páté zkumavky sestrojíme kalibrační graf, hodnoty sedmé a osmé zkumavky (měly by být totožné !) zprůměrujeme a z grafu odečteme obsah fruktosy v neznámém vzorku.
Pozn:
Při konečném zhodnocení vycházíte z toho, že např 3. zkumavka obsahovala 0,24 mg fruktosy, Je-li absorbance vašeho vzorku stejná jako u třetí zkumavky, obsahuje též 0,24 mg ve vnesených 2 ml, tj. 0,12 mg v 1 ml neboli 12 mg ve 100 ml. Hodnoty obsahu fruktosy v 1. až 5. zkumavce si odvoďte z uvedeného příkladu.
Obsahové látky některých druhů koření
Postup:
V třecí misce rozetřeme cca l - 2 g drogy (badyán, anýz,fenykl, kmín) a rozetřenou drogu převeďte do 100 ml destilační baňky. Do baňky přilijte cca 25 ml vody a upevněte ji do aparatury na destilaci s vodní parou. Za intenzivního zahřívání vyvíječe vodní páry destilujte tak dlouho, až vydestilujete alespoň 30 ml destilátu. Destilát vlijte do dělicí nálevky, přilijte nanejvýš 5 ml chloroformu a za častého "odvětrávání" (jak předvedl vyučující) třepte intenzivně asi 3-5 minut. Těkavé látky jsou takto vytřepány do chloroformu, který se po ukončení třepáni soustředí u výpustného kohoutu dělící nálevky. Chloroformovou vrstvu opatrně vypusťte do malé kádinky nebo Erlenmayerovy baňky a přisypte asi půl lžičky síranu sodného, aby byl extrakt zbaven vody. Vysušený chloroformový extrakt vylijte do malé porcelánové misky.
Na proužek tenké vrstvy Silufol o šíři cca 6 cm si měkkou tužkou označte l cm od spodního okraje místo, kam budete nakapávat chloroformový roztok. Naneste kapilárou 4x - 6x roztok tak, aby utvořil skvrnu nejvýše o průměru 5 mm. Po posledním nakapání ponechte 3 minuty zaschnout a vyvíjejte chromatogram benzenem* Jakmile čelo rozpouštědla urazí 10 cm, vyjměte chromatogram, označte polohu čela a ponechte chromatogram uschnout. Po uschnutí ho vložte do kádinky s jodovými parami a vyčkejte, až jsou jasně viditelné skvrny jednotlivých složek* Vyjměte chromatogram o vyhodnoťte RF hodnoty jednotlivých skvrn. Dvě nejintenzivnější skvrny jsou anethol (RF cca 0,60) a karvon (RF cca 0,25).
Úkol:
Vyhodnoťte počet složek (počet skvrn), jejich RF a pokuste se odhadnout relativní obsah (intenzitu skvrn) pro karvon a anethol (ve formě např: obsah karvonu a anetholu 1:4).
Stanovení absorpční křivky přírodního barviva
Princip metody:
Přírodní barviva vykazují ve viditelné oblasti světla různě velikou absorpcí v závislosti na jejich struktuře. Tomu odpovídá l i barva daného barviva, např. červenofialová u anthokyanů. Absorpční maxima i minima jsou pro danou látku charakteristické.
Potřeby:
SPECOL
červená řepa nakládaná v nálevu, višňový kompot, bezinkový extrakt apod.
kyvety o dané tloušťce
Provedení:
Nastavte SPECOL na vlnovou délku cca 530-540 nm a destilovanou vodou zřeďte extrakt anthokyanových barviv tak, aby maximální hodnota absorbance dosahovala 0,600-0,700, když jste před tím pro kyvetu s dest. vodou nastavili hodnotu absorbance 0. Poté proměříte absorpční křivku v rozmezí vlnových délek 420-620 nm. vlnovou délku zvyšujete postupně po 10 nm. Všechna měření provádíte proti destilované vodě. Hodnoty zaznamenejte do tabulky a vyneste je na milimetrový papír do grafu.
Ukázka tabulky:
Vlnová délka
420
430
Absorbance
0,213
0,220
Úkol:
Zjistěte absorpční maximum daného roztoku přírodního barviva.
Kvalitativní důkazy bílkovin
Kvalitativní důkazy bílkovin spočívají v určitých charakteristických barevných reakcích, které bílkoviny dávají prostřednictvím funkčních skupin aminokyselin s jinými látkami, nebo ve změně některých vlastností bílkovin, nejčastěji rozpustnosti a to na základě vysrážení, koagulace nebo denaturace bílkovin.
Xanthoproteinová reakce
Využívá přítomnosti aromatického jádra (obecně arenického jádra) v některých aminokyselinách ( kterých ?), které se nitruje HNO3 za vzniku žlutých nitrosloučenin. Pokud si pokapete kůži touto kyselinou, budete mít na ni žluté skvrny, důkaz, že jste z bílkovin.
K l - 3 ml roztoku bílkoviny přilijte l ml HNO3 a opatrné zahřejte. "Žlutá sedlina je důkazem přítomnosti arenických aminokyselin v roz-toku. Popište pozorování.
Milionova reakce
Rtuťnaté soli poskytují s fenolickými hydroxyly intensivní zbarvení.
K l - 3 ml roztoku bílkoviny přidejte stejný objem Milionova činidla (roztok Hg(N03)2) a opatrné zahřejte. Popište zbarvení sedliny.
Biuretová reakce:
Má jméno po biuretu, sloučenině H2N-CO-NH-CO-NH2 ,která poskytuje s měďnatými solemi komplex se specifickým zbarvením. Peptidická vazba bílkovin dává stejné zbarveni, které při nepozorné práci je překryto barvou Cu++ iontů.
K l - 3 ml roztoku bílkoviny přilijte stejný objem 5% NaOH a jen jednu kapku roztoku CuSO4. Promíchejte a nechtě usadit sedlinu. Barva roztoku nad ni musí být jiná než modrá. Popište pozorování.
Důkaz síry v bílkovinách.
Tato reakce využívá tvorby sulfidu olovnatého při reakci některých typů organicky vázané síry se solemi olovnatými.
K l - 3 ml roztoku bílkoviny přilijte stejný objem roztoku NaOH (10 %) a několik kapek roztoku octanu olovnatého. Vytvoří se (někdy velmi slabě zbarvená) sedlina, která po zahřátí po dobu 3-5 minut se zbarvi. Popište pozorováni.
Reakce s Paulyho činidlem
Bílkoviny, které obsahují aminokyseliny s fenolickou nebo imidazolovou složkou, kopulují se s diazoniovými solemi za vzniku azobarviv zcela obdobně jako fenoly nebo aromatické aminy.
Chemikálie:
10% Na2C03
Paulyho roztoky I a II (I - roztok 0,1 g sulfanilové kyseliny v 5 ml konc. HCl se doplní destilovanou vodou na 100 ml; II - 0,5 g NaNO2 ve 100 ml destilované vody)
roztok bílkoviny
Smísením Paulyho roztoků v poměru 1:1 se sulfanilová kyselina diazotuje:
Kopulací vzniklé diazoniové soli s aromatickými aminy nebo fenoly (tedy i s aminokyselinami bílkovin, jako je tyrosin nebo histidin) vznikají charakteristická azobarviva.
K 1-2 ml roztoku bílkoviny přidejte stejný objem 10% roztoku uhličitanu sodného. Potom l ml směsi obou Pualyho roztoků (1:1). Za přítomnosti tyrosinu nebo i histidinu v molekule bílkoviny barví se směs červeně.
Koagulace bílkovin
Koagulace bílkovin může být reversibilní nebo ireversibilní. K reversibilní koagulaci dochází např. účinkem některých rozpouštědel (např. acetonem, octovou kyselinou nebo účinkem koncentrovaných roztoků neutrálních solí -tzv. vysolování, např. síranem amonným), přičemž se obvykle vysráží,aniž by došlo k její denaturaci.
Teplem, ionty těžkých kovů (Cu,Pb, Hg) nebo působením některých specifických anorganických a organických sloučenin, např. trichloroctovou kyselinou, sulfosalicylovou, kyselinou wolframovou, taninem, fenolem, formaldehydem, nastává ireverzibilní koagulace za vzniku danaturovaného stavu bílkoviny.
Vysolování bílkovin z roztoků a koagulace bílkovin zahříváním
Chemikálie:
nasycený roztok síranu amonného
vodný roztok bílkoviny
Ke 2 ml vodného roztoku vaječného bílku přidejte asi stejný objem nasyceného roztoku síranu amonného a obsahem zkumavky protřepejte; vytvoří se sraženina. Odlejte l ml roztoku se suspensí a přidejte 2-3 ml vody a znovu protřepejte, Čímž se opět sraženina rozpustí, čirý roztok potom zahřejte k varu. Vyloučí se klky nedenaturované bílkoviny, která se ani přidáním vody ani síranu amonného již nerozpustí.
Koagulace bílkovin
a) solemi těžkých kovů
Chemikálie:
nasycený roztok CuSO4
20% roztok octanu olovnatého roztok bílkoviny
Asi k l ml roztoku bílkoviny přikapávejte za protřepávání roztok síranu měďnatého. Vytváří se modrá sraženina nebo zákal, která se při dalším přidávání roztoku měďnaté soli rozpouští. Podobný jev nastává, když použijeme roztoku octanu olovnatého. Vytvořená sraženina je však bílá.
b) pikrovou kyselinou, fenolem a formaldehydem
Chemikálie:
roztok bílkoviny fenolová voda 30% roztok formaldehydu nasycený roztok pikrové kyseliny
Po l ml vodného roztoku vaječného bílku odměřte do tří zkumavek. Fenol koaguluje bílkoviny rychle, formaldehyd po několikaminutovém stání, pikrová kyselina vytváří s bílkovinou žlutou sraženinu.
cvičení
©Katedra chemie ČZU v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol
(02/2438 2721
100°C
90
80
70
60
50
40
0 5 1015 20 253035 %
Přibližný obsah rozpouštědla
Odhad tepoty varu