6-cviceni-ABCH-10

sledujícího schématu:
Reagencie (ml) Slepý pokus Test
Pufr 0,5 -
Antisérum v pufru - 0,5
Vzorek moči 0,02 0,02
ƒ Důkladně promíchejte jemným protřepáváním a nechejte stát 30 minut při pokojové teplotě.
Před zahájením měření kyvety opět jemně protřepejte. Pak postupně, dle pokynů na displeji,
vkládejte do přístroje slepý pokus a vzorky.

Úkol 6.3 Elektroforéza proteinů
Proteiny migrují v elektrickém poli různou rychlostí, která závisí na jejich struktuře, elektrickém
napětí, pufru (pH a iontová síla), elektroendoosmóze a charakteru nosiče. K dělení proteinů krevního
séra je použit agarosový gel. Rozdělené zóny proteinů jsou obarveny v roztoku amidočerně,
hodnocení se provádí denzitometricky.
Materiál: Elektroforetická souprava firmy Sebia: 0,05 mol/l Tris-barbitalový pufr pH 8,6, barvicí roztok (0,5% roztok
amidočerně), fixační roztok (ethanol:octová kyselina:voda, 6:1:3 v/v/v), odbarvovací roztok, vzorky sér,
fyziologický roztok. Fólie s agarosovým gelem, aplikační šablonka, migrační komora CUVE K 20.
Mikrodávkovač 5 μl, filtrační papír, elektrický vysoušeč, zdroj napětí.
Biochemický ústav LF MU 6. cvičení
40
Provedení
ƒ Příprava vzorku. Vzorky sér jsou naředěny (20 μl séra a 100 μl fyziologického roztoku).
ƒ Příprava gelu. Z obalu vyjměte fólii s agarosovým gelem a položte jí na filtrační papír
lícovou stranou nahoru. Do místa aplikace vzorků (v rovině šipek) položte na několik
sekund pás filtračního papíru ze soupravy z důvodu odsátí přebytečné vlhkosti.
ƒ Aplikace vzorků. Do roviny šipek opatrně položte aplikační šablonku a do výřezů v šablonce
odměřujte po 5 μl vzorků séra. Nechejte vsakovat 5–10 min, potom odsajte nevsáklá séra
přiložením pruhu filtračního papíru a pak sejměte šablonku.
ƒ Elektroforetická separace. Do migrační komory odměřte ke každé elektrodě 150 ml pufru a
založte agarosovou fólii lícovou stranou dolů (vzorky na straně katody). Migrace probíhá
30 minut za konstantního napětí 70 V. Po dosažení tohoto napětí je třeba zkontrolovat
proud, který by měl být 22 ± 3 mA na jednu fólii.
ƒ Fixace a barvení. Po ukončení migrace umístěte fólii na 15 minut do fixačního roztoku.
Poté gel vysušte v proudu horkého vzduchu (max. teplota 80 °C). Na fólii nesmí být po
vysušení patrné stopy vlhkosti. Pak suchou fólii umístěte na 5 min do roztoku amidočerně.
Odbarvení gelu proveďte ve dvou lázních odbarvovacího roztoku.
ƒ Sušení gelu. Fólii vysušte v proudu horkého vzduchu nebo při laboratorní teplotě.



" 1. Na čem je založen princip stanovení proteinů biuretovou reakcí.
" 2. Uveďte princip nefelometrie. Jaká vlnová délka je volena pro nefelometrická stanovení? Zdůvodněte.
" 3. Popište v bodech postup použití přístroje Turbox.
" 4. Jakým způsobem ovlivní elektroforetickou pohyblivost proteinů: a) změna elektrického napětí;
b) změna pH prostředí c) změna koncentrace separačního pufru; d) změna hustoty gelu;
e) elektroosmóza?
" 5. Uveďte princip elektroosmózy (při separaci látek na agarosových gelech hraje významnou roli).
" 6. Jaký náboj budou mít proteiny krevní plazmy při použitých podmínkách dělení?
" 7. Na jakém principu je založena fixace proteinů v gelu po elektroforetické separaci?