6-cviceni-ABCH-10

ze těla, na
námaze). Proto je nutné vyšetřovat první ranní moč (zachycení noční klidové proteinurie). "Neškodné" fyziologické
proteinurie se vyskytují zvláště u mladých osob při zhoršeném prokrvení ledvin, např. po tělesné námaze, silných emocích,
dlouhém stání.
Biochemický ústav LF MU 6. cvičení
38
Při pozitivním nálezu bílkoviny v moči je užitečné zjistit i celkové množství bílkovin vyloučených za
24 hodin. Fyziologicky se močí vylučuje za 24 hodin 40–100 mg proteinů s maximem 150 mg.
U zdravých jedinců nepřekročí obvykle vylučování albuminu močí hodnotu 30 mg/den. Horní mez
fyziologické koncentrace albuminu v ranní moči je 20 mg/l. Při malém zvýšení permeability bazální
membrány glomerulů dochází ke zvýšené exkreci proteinů se střední molekulovou hmotností, nejvíce
albuminu (M
r
68 000).
Toto malé množství albuminu (mikroalbuminurie) ještě není prokazatelné běžnými testy na proteinurii (citlivost nad 100
mg/l). Zvýšené hodnoty signalizují počátek poruchy glomerulární filtrace (např. u diabetiků v důsledku neenzymové glykace
kolagenu v bazální membráně glomerulů nebo u hypertoniků v důsledku zvýšeného filtračního tlaku). Včasné zjištění
mikroalbuminurie je však velmi důležité, poněvadž odhalí počáteční fázi nefropatie. Stanovení se provádí v čerstvé ranní
moči, po vyloučení manifestní proteinurie.
Kromě kvantifikace ztrát bílkovin je výhodné znát i spektrum vylučovaných proteinů k posouzení
selektivity a k rozlišení původu proteinurie. K tomu se používají hlavně metody elektroforézy
v agarozovém nebo polyakrylamidovém gelu, dále stanovení albuminu a β
2
-mikroglobulinu.

PRAKTICKÁ ČÁST
Úkol 6.1 Stanovení celkových proteinů biuretovou reakcí
Látky obsahující peptidovou vazbu reagují s ionty Cu
2+
v alkalickém prostředí za vzniku
červenofialového komplexu.
Materiál: BioLATest Celkové bílkoviny (TP 300): Pracovní roztok biuretového činidla (100 ml roztoku CuSO
4
15 mmol/l
a EDTA.Na
2
0,18 mmol/l, se zředí vodou na 600 ml, za vydatného míchání se postupně přidá 200 ml roztoku
NaOH 5 mol/l a doplní vodou na 1 litr). Kalibrační roztok proteinů (koncentrace uvedena na štítku), vzorky
krevních sér. Pipetory pro objem 20 µl a 1,5 ml.
Provedení
ƒ Do čistých, označených zkumavek odměřujte podle schématu:
Roztok (ml) Slepý pokus Vzorek Standard
Biuretové činidlo 1,5 1,5 1,5
Demi-voda 0,02 - -
Sérum - 0,02
Kalibrační roztok - - 0,02
Promíchejte a po 20 minutách změřte absorbance vzorků A
x
a standardu A
STD
při 545 nm
proti slepému pokusu. Zbarvení je stálé asi hodinu.

Biochemický ústav LF MU 6. cvičení
39
ƒ Výpočet hmotnostní koncentrace proteinů v séru:
STD
STD
x
x
ρρ ×=
A
A

kde ρ
STD
je hmotnostní koncentrace proteinů v kalibračním roztoku (uvedena na štítku)
Úkol 6.2 Imunonefelometrické stanovení mikroalbuminurie
Proteiny se stanovují pomocí imunoprecipitace v roztoku s následným nefelometrickým měření
intenzity vzniklého zákalu.
Materiál: Roztok antiséra (připraven smícháním specifického antiséra pro lidský albumin s pufrem), pufr, vzorky močí.
Mikrodávkovače 20 µl, 500 ul, nefelometr Turbox
®
.
Provedení
ƒ Do kyvet určených pro Turbox
®
pipetujte dle ná