3-cviceni-ABCH-10

(např. 200) světlocitlivých diod a vzniká napětí, které je převedeno na digitální signál. Tyto
detektory umožňují měřit současně celé spektrum, např. v rozsahu 200 až 700 nm.
Pro fotometrická měření se používají kyvety skleněné a plastové (pro viditelnou oblast spektra)
nebo křemenné pro měření v ultrafialové oblasti. Tloušťka kyvety bývá obvykle 1 cm (při
manuálním měření, analyzátory s fotometrickou detekcí používají kyvety menších rozměrů),
běžné je i používání průtokových kyvet a průtokových cel. Kyveta s roztokem měřeného vzorku
se vkládá mezi filtr, resp. mřížku a detektor.
Biochemický ústav LF MU 3. cvičení
18

PRAKTICKÁ ČÁST
Úkol 3.1 Spektrofotometrické stanovení salicylové kyseliny
Acetylsalicylová kyselina (ASA, z angl. acetylsalicylic acid, pK
A
= 4,57) bývá jednou z účinných
látek antipyretik (látek snižujících horečku). V organismu je ASA při průchodu játry
hydrolyzována na salicylát. Spektrofotometrické stanovení salicylátu je založeno na metodě, při
níž je bezbarvý salicylát převeden v kyselém prostředí na barevný komplex se železitými ionty.
Budeme předpokládat, že se vytváří komplexní kation s l molekulou salicylové kyseliny:



Takto lze nepřímo stanovit i množství ASA v tabletě medikamentu po alkalické hydrolýze na
salicylát:



Materiál: Salicylát sodný (M
r
= 160,10), železité činidlo (dusičnan železitý, 0,1 mol/l v 0,12 mol/l HCl),
roztok NaOH (1 mol/l), váženka, odměrná baňka 10 ml a 100 ml. Analytické váhy, nastavitelný
mikrodávkovač 100–1000 µl. Dělené pipety 2 ml, mikrozkumavky 1,5 ml, nízké zkumavky.
Vzorek s neznámou koncentrací salicylátu, spektrofotometr.
Provedení:
a) Příprava kalibračních roztoků salicylátu
ƒ Připravte 10 ml standardního roztoku salicylátu sodného o koncentraci 5 mmol/l.
ƒ Ředěním standardního roztoku salicylátu připravte do očíslovaných mikrozkumavek řadu
kalibračních roztoků dle tabulky. Před odměřováním vypočtěte objemy demi-vody a
standardního roztoku potřebné k přípravě 1 ml kalibračního roztoku:
Roztok č. Standardní roztok (ml) Demi-voda (ml) c (mmol/l)
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5

COOH
O
+ 3 NaOH
C CH
3
O COONa
ONa
+ CH
3
COONa + 2 H
2
O
COONa
ONa
+ 2 H
+
+ Fe
3+
C
O
O
O
Fe
3+
H
H
+ 2 Na
+
Biochemický ústav LF MU 3. cvičení
19
b) Sestrojení absorpční křivky komplexu Fe
3+
-salicylát
ƒ Do dvou zkumavek odměřte přesně skleněnou pipetou po 2 ml železitého činidla.
ƒ Do první zkumavky přidejte 100 µl kalibračního roztoku č. 3, do druhé 100 µl
deionizované vody. Důkladně promíchejte a ponechte 10 minut stát.
ƒ Pomocí spektrofotometru Spekol 11 změřte absorbance zbarveného roztoku v první
zkumavce v rozsahu vlnových délek 450–600 nm (intervaly po 10 nm). Roztok ve druhé
zkumavce použijte jako slepý vzorek. Nezapomeňte spektrofotometr vynulovat na slepý
pokus pro každou vlnovou délku.
ƒ Poté proměřte absorpční spektrum komplexu Fe
3+
-salicylát pomocí spektrofotometru
(návod bude přiložen u přístroje).
" 1. Zaznamenejte hodnoty absorbancí pro všechny vlnové délky.
" 2. Vyneste graficky na milimetrový papír závislost absorbance na vlnové délce záření.
" 3. Určete nejvhodnější vlnovou délku (maximální absorbance) pro stanovení koncentrace
salicylátu.
" 4. Vypočtěte hodnotu molárního absorpčního koeficientu komplexu Fe
3+
-salicylát v jeho
absorpčním maximu (uvědomte si správnou hodnotu koncentrace komplexu Fe
3+
-salicylát
v měřeném roztoku (0,1 ml kalibrátoru č. 3 + 2,0 ml železitého činidla)).

c) Zhotovení kalibračního grafu a stanovení koncentrace salicylátu ve vzorku
ƒ Do sedmi zkumavek odměřte přesně skleněnou pipetou 2 ml železitého činidla.
ƒ Do pěti očíslovaných zkumavek odměřte po 100 µl příslušného kalibračního roztoku, do
šesté zkumavky 100 µl neznámého vzorku a do sedmé zkumavky 100 µl deionizované
vody (slepý pokus). Důkladně promíchejte a ponechte 10 minut stát.
ƒ Změřte absorbanci všech roztoků při vlnové délce absorpčního maxima, které jste určili v
předchozí úloze, proti slepému pokusu.

" 5. Ze získaných hodnot absorbance kalibračních roztoků sestrojte kalibrační graf.
" 6. Z lineární části grafu vypočtěte kalibrační faktor.
" 7. Stanovte koncentraci salicylátu v neznámém vzorku jak odečtením z kalibračního grafu, tak
výpočtem pomocí kalibračního faktoru.
" 8. Jaké množství fotonů je absorbováno roztokem, tj. jaká je hodnota T v %, jeli hodnota
absorbance rovna: a) 0,3 b) 1,0 c) 2,0?
" 9. V jakých jednotkách se udává: a) absorbance; b) molární absorpční koeficient?