3-cviceni-ABCH-10

grafu se proloží přímka (jejíž obecná rovnice je y = k x + q).
Pokud se měří absorbance proti slepému vzorku, tak kalibrační přímka prochází počátkem
souřadnic:
A = k c
k je směrnice přímky (tj. tangenta úhlu, který svírá přímka s osou
x):
k = ΔΑ/Δc
Převrácená hodnota směrnice přímky 1/k se nazývá kalibrační faktor (F):
F = 1/k = Δc/ΔA
Pro výpočet koncentrace analytu v neznámém vzorku potom platí:
c
x
= A
x
F
Poněvadž standard i analyzovaná látka mají za daných experimentálních podmínek stejnou
hodnotu molárního absorpčního koeficientu tj. ε
std
= ε
x
, získáme po dosazení z Lambertova-
Beerova vztahu za ε rovnici A
std
/(b c
std
) = A
x
/(b c
x
), z které pro koncentraci analytu v neznámém
vzorku vyplývá:
c
x
= c
std
A
x
/ A
std

Koncentraci analyzované látky c
x
lze vypočítat ze změřených absorbancí analyzovaného vzorku
A
x
a kalibračního roztoku A
std
o koncentraci c
std
, která je blízká koncentraci analytu v neznámém
vzorku c
x
. Absorbance jsou měřeny proti slepému vzorku.
Látky barevné (tj. látky výrazně absorbující viditelné záření) lze spektrofotometricky stanovit přímo. Látky bez
výrazného absorpčního maxima ve VIS/UV oblasti je třeba nejprve reakcí s vhodným činidlem (derivatizací) převést
na zbarvený produkt. Podmínkou je, aby množství barevného produktu bylo úměrné koncentraci stanovované látky.
Intenzita zabarvení roztoku tímto barevným produktem je pak přímo úměrná koncentraci analytu v původním
analyzovaném roztoku a lze ji změřit spektrofotometrem.
Při spektrofotometrickém stanovení koncentrace je nutné dodržovat určité zásady:
• kyvety plňte do ¾ jejich objemu
• vnější stěny kyvety udržujte čisté a suché
• nedotýkejte se prsty stěn kyvety, kterými prochází světlo
• kyvetu držte pouze za boční stěny, které bývají matované nebo vroubkované
• roztok v kyvetě musí být bez bublin, příp. odstraňte sklepnutím nebo promícháním tyčinkou
• kyvetu vkládejte do držáku vždy stejnou stranou ke zdroji světla, např. ocejchovanou stranou

Přístroje, které se používají k měření zářivého toku v ultrafialové nebo viditelné oblasti spektra se
nazývají fotometry nebo spektrofotometry. Fotometry jsou jednodušší a používají k vymezení
úzkého pásma vlnových délek filtry. Spektrofotometry používají většinou mřížkový
monochromátor, který dovoluje kontinuálně měnit vlnovou délku měření v širokém intervalu.
∆c
A
∆A
c
°
°
A
x
c
x
×
°
°
°
Biochemický ústav LF MU 3. cvičení
17
Spektrofotometr mívá zpravidla citlivější detektor než fotometr a obvykle dva zdroje světla
(zvlášť pro UV a zvlášť pro VIS oblast).
Všechny fotometry a spektrofotometry sestávají ze tří základních částí:
• zdroje zářivé energie
• filtru nebo mřížky pro izolaci úzkého pásma zářivé energie
• detektoru měřicího zářivou energii propuštěnou vzorkem.

Zjednodušené schéma jednopaprskového spetrofotometru SPEKOL 11

Ve viditelné oblasti je nejčastěji používaným zdrojem světla žárovka s wolframovým vláknem.
Její spektrální charakteristiku lze významně zlepšit halogenovou atmosférou. Kromě toho jsou
rozšířené různé typy zdrojů elektrického výboje. V UV oblasti to jsou deuteriové výbojky (190 až
375 nm), pro UV + VIS spektra xenonové a rtuťové výbojky. Excitace výbojky je vyvolána
průchodem elektronů plynem.
Pro selektivitu, správnost a citlivost všech měření je nutné vybrat úzké pásmo vlnových délek,
vyzařovaných ze širokospektrálního zdroje. K tomu účelu se obvykle používají interferenční
filtry nebo reflexní mřížky (nemají ztrátu světla absorpcí). Mřížka je vedle vstupní štěrbiny,
vymezující svazek heterochromatického záření, a výstupní štěrbiny, propouštějící pásmo světla
blízké nominální vlnové délce, nejdůležitější částí optického zařízení k získání
monochromatického světla, tzv. monochromátoru.,
Detektory používané ve VIS a UV oblasti převádějí zářivou energii na elektrickou energii.
Používají se fotonky, fotonásobiče a diodová pole. Ve fotonkách se elektrony uvolněné z
fotokatody po dopadu fotonů pohybují k anodě účinkem napětí. Je-li fotonka plněná plynem,
elektrony cestou ionizují jeho molekuly, takže na anodu dopadne větší počet elektronů, než byl
uvolněn z katody. Fotonásobiče jsou uspořádány tak, že elektrony dopadnou po ozáření
fotokatody na první zesilovací elektrodu, tzv. dynodu, kde je počet fotoelektronů násobem
sekundární emisí. Takových dynod je ve fotonásobiči 10 i více a výsledný efekt zesílení může být
i několik milionů. V detektoru diodového pole je světlo rozptylováno mřížkou na pole mnoha