- Stahuj zápisky z přednášek a ostatní studijní materiály
- Zapisuj si jen kvalitní vyučující (obsáhlá databáze referencí)
- Nastav si své předměty a buď stále v obraze
- Zapoj se svojí aktivitou do soutěže o ceny
- Založ si svůj profil, aby tě tví spolužáci mohli najít
- Najdi své přátele podle místa kde bydlíš nebo školy kterou studuješ
- Diskutuj ve skupinách o tématech, které tě zajímají
Studijní materiály
Zjednodušená ukázka:
Stáhnout celý tento materiálBiochemický ústav LF MU 3. cvičení
14
SPEKTROFOTOMETRIE
Metody kvantitativní analýzy se často zakládají na určení absorpce elektromagnetického záření z
oblasti ultrafialové (vlnová délka λ < 380 nm) nebo viditelné části spektra (λ = 380 – 780 nm)
stanovovanou látkou. Molekuly absorbují elektromagnetické záření pouze takové energie
(kvantum energie), která je přivede do vyššího (excitovaného) energetického stavu. Tuto energii
lze vyjádřit pomocí vztahu:
ΔE = h ν = h c / λ
kde h je Planckova konstanta, ν frekvence absorbovaného záření, c rychlost světla ve vakuu, λ vlnová délka absorbovaného
záření.
Vlnová délka (λ) absorbovaného elektromagnetického záření, je tedy určena vzdáleností dvou
sousedních energetických hladin (ΔE) molekul dané látky, mezi kterými molekuly přechází.
Pokud monochromatické záření (záření o dané vlnové délce) o zářivém toku P
0
prochází vrstvou
absorbující látky b, dochází k pohlcení (absorpci) části záření, takže vycházející
elektromagnetické záření má zářivý tok P nižší, než záření dopadající.
Množství absorbovaného záření může být vyjádřeno dvojím
způsobem:
- jako transmitance (propustnost): T = P / P
0
- často se udává jako procento prošlého záření T = 100 P / P
0
%
- jako absorbance: A = log(P
0
/ P) = log(1 / T) = −logT
- zastaralé pojmy pro absorbanci jsou optická hustota (OD, z angl. optical
density) nebo extinkce (E) se nedoporučují používat
Vztah mezi transmitancí a absorbancí vyjadřuje následující schéma:
Pokud nedochází k absorpci záření při jeho průchodu látkou, tak transmitance je rovna 100 % a
absorbance je nulová. Pokud veškeré záření je pohlceno roztokem, tak transmitance je nulová a
absorbance je nekonečno.
Velikost absorpce elektromagnetického záření závisí na třech faktorech, na vlnové délce záření,
koncentraci absorbující látky v roztoku a na tloušťce měřené vrstvy.
Při dané vlnové délce záření existuje mezi koncentrací absorbující látky a absorbancí přímá
úměra. Tuto závislost vyjadřuje Lambertův-Beerův zákon (někdy označovaný pouze jako
Beerův zákon):
A
λ
= ε
λ
b c
P
P
0
b
%Transmitance
Absorbance
Biochemický ústav LF MU 3. cvičení
15
kde ε
λ
je molární absorpční koeficient (neboli molární absorptivita, jeho hodnota odpovídá absorbanci látky o
koncentraci 1 mol/l a tloušťce měřené vrstvy 1 cm), c je látková koncentrace (mol/l) a b tloušťka měřené vrstvy (cm).
Absorbance je aditivní veličina, tj. pokud je v roztoku přítomno více látek, které absorbují při
dané vlnové délce, tak celková absorbance roztoku je dána vztahem:
A
celková
= A
1
+ A
2
+ ... = ε
1
b c
1
+ ε
2
b c
2
+ ...
Lambertův-Beerův zákon platí pouze pro:
• monochromatické záření
• zředěné roztoky (< 10
−2
mol l
−1
)
• homogenní roztoky (nedochází k rozptylu záření na částicích vzorku)
• vzorky, které nefluoreskují ani nefosforeskují při dané vlnové délce
• monomerní látky, které v roztoku neasociují
Závislost absorbance na vlnové délce nazýváme absorpční spektrum (absorpční křivka).
Absorpční spektrum je charakteristické pro danou sloučeninu. Praktický význam mají absorpční
maxima křivky a jim příslušející vlnové délky. Ke stanovení koncentrací absorbujících látek se
volí zpravidla vlnové délky těchto maxim, poněvadž stanovení je nejpřesnější (viz obrázek) a
současně i nejcitlivější (viz Lambertův-Beerův zákon).
Z absorpční křivky lze též vypočítat hodnoty molárních absorpčních koeficientů, známe-li
koncentraci absorbující látky, pro kterou byla absorpční křivka sestrojena:
ε
λ
max
= A
max
/ b c
Protože hodnota molárního absorpčního koeficientu závisí na konkrétních experimentálních
podmínkách, tak se v podstatě vždy při spektrofotometrických stanoveních koncentrace vychází
z kalibračního grafu. K jeho zhotovení se připraví z nejčistšího preparátu stanovované látky
(standardu) standardní roztok a jeho ředěním řada kalibračních roztoků. Každý kalibrační roztok
se zpracuje stejným postupem jako vzorky s neznámou koncentrací. Poté se změří jejich
absorbance proti rozpouštědlu nebo činidlu bez měřené látky (slepému vzorku/pokusu, angl.
blank). Naměřené hodnoty se vynesou do grafu jako závislost absorbance kalibračních roztoků na
a
b
Abs
o
rba
n
ce
Koncentrace
A
λ
λ
max
A
max
a
b
Biochemický ústav LF MU 3. cvičení
16
jejich koncentraci. Závislost je lineární pro rozsah koncentrací, ve kterém platí Lambertův-Beerův
zákon. Odchylky od přímky jsou běžné u vysokých koncentrací. Body ležícími v lineární části
Vloženo: 26.05.2011
Velikost: 273,79 kB
Komentáře
Tento materiál neobsahuje žádné komentáře.
Mohlo by tě zajímat:
Skupina předmětu ABCH - Biochemie
Reference vyučujících předmětu ABCH - Biochemie
Copyright 2024 unium.cz