4-cviceni-ABCH-10

zné
vzdálenosti od místa startu. Nebarevné látky musí být vizualizovány postřikem vhodným detekčním
činidlem.
Separace molekul při gelové filtraci
Biochemický ústav LF MU 4. cvičení
24

Hodnocení chromatogramu. Na suchém chromatogramu hodnotíme přímo polohu skvrn barevných
látek, zóny nebarevných látek je nutno odkrýt vhodným detekčním činidlem.
Pro každou zónu vypočteme hodnotu R
F
– retardační faktor. Je to poměr vzdálenosti středu
koncentračního maxima zóny od startu ke vzdálenosti čela mobilní fáze od startu.

Chromatografie na tenké vrstvě a princip hodnocení

Protože existuje značné množství faktorů (např. teplota, malé odchylky ve složení chromatografické
soustavy, vlhkost), které do jisté míry ovlivňují polohu zóny, a tedy hodnotu R
F
, vyvíjíme obvykle na
chromatogramu zároveň vzorek standardu (autentické látky). Dosáhne-li standard a látka oddělená
z neznámého vzorku stejné hodnoty R
F
(a to nejméně ve třech různých chromatografických
soustavách), je pravděpodobné, že se jedná o látky chemicky totožné. Množství látky v zóně lze
odhadnout podle její plochy, kvantitativně stanovit denzitometrem, či po vymytí látky ze zóny
vhodným rozpouštědlem.
Sloupcová chromatografie
Při sloupcové chromatografii je stacionární fáze naplněna do skleněné kolony a mobilní fáze protéká
kolonou buď samovolně působením gravitace nebo je průtok urychlen působením tlaku. Klasická
sloupcová chromatografie se využívá k separaci látek. Látky se dělí na základě rozdílné afinity ke
stacionární a mobilní fázi. Nejčastěji se používá eluční uspořádání, tj. látky jsou po rozdělení na
koloně postupně eluovány a zachytávány ve formě frakcí vytékajících z kolony. Pokud jsou barevné,
je možno jejich dělení pozorovat přímo na koloně. Nebarevné látky musí být vizualizovány po
vytečení z kolony. Používá se buď reakce s vhodným činidlem, fotometrie eluátu při určité vlnové
délce, příp. měření jiného parametru eluátu.
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, HPLC
(z angl. high-performance liquid chromatography)
Eluční sloupcová chromatografie byla v posledních desetiletích podstatně zdokonalena a
zmechanizována. Hlavní podíl na tom má vývoj nového sortimentu stacionárních fází. Vysoké
účinnosti separačního procesu je dosaženo použitím kolon s velmi jemně zrněným sorbentem
(3–10 μm), s dobře definovanou velikostí částic, kolony se vyznačují vysokou hustotou a homogenitou
25
náplně. Separační proces je tak účinnější a kratší, používané kolony mají menší rozměry. S klesající
velikostí částic však stoupá odpor kolony a na dosažení potřebné rychlosti průtoku mobilní fáze je
třeba použít tlak jednotek až desítek MPa. Proto se tato separační technika někdy označuje jako
vysokotlaká kapalinová chromatografie (angl. high-pressure liquid chromatography).
V klinicko-biochemické praxi je HPLC využívána pro sledování hladiny různých léků, metabolitů, vitamínů, hormonů, apod.

Základní komponenty HPLC systému jsou:
• Zásobník mobilní fáze
• Vysokotlaké čerpadlo, zajišťující průtok mobilní fáze kolonou
• Dávkovací zařízení
• Dělící kolona
• Detektor
• Integrátor (počítač)
Zásobníky mobilní fáze slouží jako rezervoáry mobilní fáze. Mobilní fáze je z nich čerpadly
transportována na kolony. Mobilní fáze musí být před čerpáním zbavena rozpuštěného plynu, aby
se z ní při vyšším tlaku neuvolňovaly v koloně bubliny. Odplynění se provádí ultrazvukem,
sníženým tlakem nebo varem.
Vysokotlaká čerpadla musí zajistit konstantní (nebo programovatelný) bezpulzní průtok (0,1−10
ml/min) při tlacích do 60 MPa. Moderní přístroje využívají obvykle dvě pulzní pístová čerpadla,
jejichž činnost je fázově posunuta a pohybují se tak, aby došlo k maximálnímu potlačení pulzace toku
mobilní fáze.
Mobilní fáze může mít konstantní polaritu, kdy čerpadlo pumpuje do kolony jediné rozpouštědlo
(např. metanol). Tento režim, který se nazývá isokratický, se používá nejčastěji. Je také možné
měnit eluční sílu mobilní fáze tak, že se postupně mění zastoupení dvou nebo více rozpouštědel.
Tento postup vyžaduje čerpadlo gradientové, s programátorem gradientu.
Dávkovací zařízení. Při dávkování vzorku je nutné překonat velký pracovní tlak uvnitř kolony.
Nejčastěji se v HPLC používá 6-cestný injekční ventil s vyměnitelnou smyčkou (např. Rheodyne).
Mobilní fáze
Kolona
Detektor Integrátor
Pumpa
Dávkovací ventil
Biochemický ústav LF MU 4. cvičení
26
Schematický diagram smyčkového dávkovače uvádí obrázek. V pozici „load“ je vzorek naplněn
pomocí stříkačky do dávkovače. Přitom se vzorkem zaplní externí smyčka (obvykle 5 – 100 μl).
Během plnění smyčky prochází mobilní fáze ventilem na kolonu. V pozici „inject“ rotuje ventil tak, že
mobilní fáze nyní začne procházet přes smyčku a vzorek je tak vnesen na kolonu.
Obsluha jednoduchých smyčkových dávkovačů je
manuální, pro sériové analýzy se používají automatické
dávkovače (tzv. autosamplery).
Chromatografické kolony se zhotovují z nerezové
oceli nebo ze skla. Nejvýhodnější jsou kovové kolony,
jejichž vnitřní povrch je potažen vrstvou skla.
V současnosti se obvykle používají kolony o délce 10
až 30 cm, průměr analytických kolon bývá v řádu
jednotek milimetrů. Účinnost kolony závisí na použité
stacionární fázi, na délce kolony a na jejím tvaru, na
materiálu kolony, na úpravě vnitřního povrchu kolony a na množství spojovacích částí. Kolony lze
plnit stacionární fází přímo v laboratoři, nebo je možné je koupit hotové od výrobců, což je běžnější.
Náplně kolon se volí v závislosti na charakteru analyzovaných sloučenin a principu, který má být
při dělení uplatněn. Kolony musí být mechanicky stabilní při pracovních tlacích do 30–40 MPa,
mají mít vysokou účinnost a poskytovat symetrické píky i při separaci polárních, kyselých,
bazických či vysokomolekulárních látek (peptidů, proteinů, atp.) a měly by mít co nejvyšší
permeabilitu (malý odpor i při vysokých průtocích mobilních fází), aby bylo možno dosáhnout
rychlých separací. Při HPLC se obecně mohou uplatňovat všechny z interakcí, které byly uvedeny
v přehledu výše. V současné době existuje obrovská škála komerčně připravených kolon
s různými typy náplní. Nejběžnější aplikací současné HPLC je chromatografie na reverzních
fázích. Kolony jsou v tomto případě plněny silikagelem C18, což je silikagel s chemicky
navázanými oktadecylovými zbytky. V některých případech se namísto 18-uhlíkatých zbytků na
silikagel navazují uhlovodíkové zbytky C8, C12 nebo skupiny –C≡N, fenylové příp. další
skupiny. Vývoj směřuje ke zvyšování selektivity dělení a zmenšování rozměrů částic, což vede ke
zkracování doby analýzy.
Novým trendem je použití kapilárních kolon, jejichž průměr je srovnatelný s velikostí částic náplně.
Vedle analytických kolon se pracuje též se speciálními kolonami preparačními o velkém průměru a
délce. Před nebo za analytickou nebo preparační kolonu se zařazují předkolony a postkolony.
Předkolony slouží hlavně k ochraně vlastní kolony, předkolony i postkolony mohou být využity
k derivatizaci analytu. Kolony mohou být temperovány – k tomu slouží kolonové termostaty.
Detektory slouží k tomu, aby eluent vytékající z kolony mohl být kontinuálně monitorován. Musí
rozeznat specifický signál eluovaných látek od signálu rozpouštědel. Nejčastějším typem detektoru je
UV/VIS detektor. Rozpouštědla používaná v HPLC obvykle v UV/VIS oblasti neabsorbují a UV/VIS
detektor lze použít k detekci mnoha látek. UV detektor může pracovat při určité vlnové délce nebo lze
vlnové délky libovolně měnit, obvykle v rozsahu 190–600 nm. Citlivost UV detektorů je obvykle
v rozsahu absorbancí 0,001–1,0 (což odpovídá ng analytu).
Princip smyčkového dávkovače
27
Spektrometrický detektor s diodovým polem (angl. diode array detector, DAD) je detektor
umožňující snímat absorpční spektrum v závislosti na čase. Výsledkem je trojrozměrný záznam
absorpčních spekter všech eluovaných látek. Diodové pole však poskytuje jednodušší spektrum než
spektrum měřené v kyvetě, identifikace látky podle zaznamenaného spektra je špatně uskutečnitelná.
Slouží zejména k posouzení čistoty zaznamenaného píku analyzované látky. Citlivost je asi o 1 řád
horší než u UV/VIS detektorů.
Látky, které vykazují přirozenou fluorescenci anebo mohou být vhodnou reakcí na fluoreskující látky
převedeny (předkolonová nebo postkolonová derivatizace) mohou být detekovány fluorescenčními
detektory. Detektory jsou velmi citlivé a selektivní, lze stanovit až pikogramy analytu.
Velmi citlivé jsou elektrochemické detektory. Podle principu měření se dělí na amperometrické a
coulometrické. Měří se změna proudu (amperometrický detektor) nebo potenciálu (coulometrický
detektor) při průchodu vzorku mezi dvěma elektrodami v průtokové kyvetě. Jedna z těchto elektrod
funguje jako referenční, zatímco potenciál druhé lze nastavit tak, aby vzorek v kyvetě byl oxidován
nebo redukován.
Hmotnostní detektory (MS detektory – z angl. mass spectrum) jsou velmi účinným prostředkem pro
identifikaci látek vytékajících z kolony. Umožňují měřit jejich hmotnostní spektrum, které je pro
každou látku vysoce specifické. Spojení HPLC a MS je však technicky i finančně dosti náročné, např.
vzhledem k tomu, že HPLC separace se provádí za vysokých tlaků, MS měření v hlubokém vakuu,
hmotnostní spektrometr je třeba navíc chránit před nadbytkem vody a solí apod. Za chromatografickou
kolonu se umísťuje dělič toku, který k detektoru přivádí pouze část eluentu z kolony.
Výstup z detektoru je obvykle připojen k počítači se softwarem umožňujícím převod analogového
signálu do digitálního formátu, jeho uložení a zpracování.
Záznam odezvy chromatografického detektoru na čase se nazývá chromatogram. Zóny separovaných
látek procházející detektorem jsou zaznamenávány jako koncentrační profily (chromatografické píky).
V ideálním případě je chromatografický pík symetrický a má Gaussovský tvar. Množství daného
analytu odpovídá ploše resp. výšce pod eluční křivkou (píkem).
Základní parametry separace v kolonové chromatografii
Retenční čas komponenty vzorku (t
r
) −
časový interval od nástřiku vzorku do
okamžiku detekce odpovídající průchodu
maximální koncentrace látky detektorem.
Mrtvý čas kolony (t
0
) − časový interval od
nástřiku vzorku do okamžiku detekce
maximální koncentrace složky, jež není
stacionární fází zadržována.
Šířka chr