- Stahuj zápisky z přednášek a ostatní studijní materiály
- Zapisuj si jen kvalitní vyučující (obsáhlá databáze referencí)
- Nastav si své předměty a buď stále v obraze
- Zapoj se svojí aktivitou do soutěže o ceny
- Založ si svůj profil, aby tě tví spolužáci mohli najít
- Najdi své přátele podle místa kde bydlíš nebo školy kterou studuješ
- Diskutuj ve skupinách o tématech, které tě zajímají
Studijní materiály
Zjednodušená ukázka:
Stáhnout celý tento materiálomatografického píku (W) −
odečítá se na úrovni základní linie, v polovině
výšky píku (W
1/2
) nebo v inflexním bodu,
udává se v časových jednotkách.
baseline
h
Chromatogram a základní parametry
Biochemický ústav LF MU 4. cvičení
28
Výška píku (h) − vzdálenost mezi maximem píku a jeho nulovou linií (angl. baseline).
Plocha píku (A) − plocha vymezená tečnami vzestupné a sestupné linie píku a základní linií, určuje se
výhradně metodou numerické integrace.
Redukovaný retenční čas (t´
r
) − charakterizuje dobu, po kterou se analyt zdrží interakcemi se
stacionární fází: t´
r
= t
r
– t
0
Retenční (kapacitní) faktor (k) − definován výrazem: k = t´
r
/ t
0
Rozlišení (R
S
) − definováno vztahem: R
s
= 2(t
r2
– t
r1
) / (W
2
+ W
1
)
• hodnota rozlišení umožňuje číselně vyjádřit úroveň separace
• látky považujeme za zcela oddělené, jestliže R
s
> 1,5
• v případě symetrických píků mnohdy postačí k rozlišení R
s
= 1
Plynová chromatografie
Při plynové chromatografii je mobilní fází plyn. Stacionární fází může být pevná látka a metoda se označuje jako adsorpční
plynová chromatografie, nebo kapalina, a pak se jedná o rozdělovací plynovou chromatografii. Těmito technikami lze dělit
všechny látky, které je možno po zahřátí kolony na pracovní teplotu (až 400 °C) převést bez rozkladu na plynnou fázi. U
látek s vysokou teplotou varu se provede derivatizace, tj. reakce, jejímž výsledkem jsou deriváty původní sloučeniny s nižší
teplotou varu. Pevné vzorky se předem rozpustí v těkavých kapalinách.
Dělení probíhá v kolonách v plynovém chromatografu. Vzorky se nastřikují do vyhřívaného dávkovače přes plynotěsnou
elastickou membránu velmi přesnou stříkačkou. Pak dochází ke zplynění vzorku a jeho páry jsou nosným plynem, jímž je
zpravidla dusík nebo argon, unášeny do vyhřívané kolony. Používají se kolony náplňové nebo kapilární. Při průchodu
kolonou se jednotlivé látky dělí na principu adsorpční nebo rozdělovací chromatografie. Po rozdělení procházejí separované
sloučeniny detektorem. Detektor pracuje na principu plamenoionizačním, kde se rozdělené složky zavádějí do plamene
vodík-vzduch a sleduje se jejich ionizace, nebo se jedná o detektor elektronového záchytu, kde dochází k záchytu elektronů
z beta-zářiče eletronegativními atomy stanovované látky a tím ke snížení měřeného ionizačního proudu. Signál jde na
analogový zapisovač a integrátorem je zpracován na číselný výstup.
Pro stanovení jednotlivých složek separovaných plynovou chromatografií lze použít také hmotnostního spektrometru.
Tento způsob detekce nabízejí špičkové plynové chromatografy. V iontovém zdroji hmotnostního spektrometru při vysokém
vakuu dostávají molekuly pozitivní náboj. Pak procházejí elektrickým polem, kde se jednotlivé fragmenty i molekulový
kation urychlují podle velikosti náboje a kolmo působícím magnetickým polem, kde se vychylují podle své hmotnosti a
dopadají na detektor (počítač částic). Tak vzniká hmotnostní spektrum, které charakterizuje nejen kvantitativní zastoupení
látek, ale také velmi spolehlivě vypovídá o jejich kvalitě (tj. o jakou sloučeninu se jedná).
0.0 2,5 5,0 7,5 10,0
Čas (min)
0
5
10
15
20
25
Odezva
detektoru
(mV)
cystein
homocystein
glutathion
cysteinylglycin
vnitřní standard
N-acetylcystein
Ukázka chromatogramu nízkomolekulárních thiolů plazmy
(thioly jsou před separací specificky navázány na fluorofor) – detekce fluorescenční
29
PRAKTICKÁ ČÁST
Úkol 4.1 Gelová chromatografie blue dextranu a fenolové červeně
Jednou z aplikací gelové filtrace je tzv. skupinová separace tj. oddělení vysokomolekulární látky od
nízkomolekulární. V této úloze se jedná o modelový pokus, při němž na Sephadexu G-25 je dělena
směs Blue Dextran 2 000 a fenolové červeně. Blue Dextran 2 000 je polysacharid značený modrým
barvivem, s molekulovou hmotností 2 000 000. Fenolová červeň má molekulovou hmotnost 354,4.
Materiál: Sephadex G25 (2 g, nabobtnaný aspoň 3 h v deionizované vodě), blue dextran 2000 (20 mg/ml),
fenolová červeň (0,5 % roztok), skleněná chromatografická kolona, skleněná tyčinka, nálevka, 2
kádinky 150 ml, zkumavka, dělená plastová pipetka, vata, stojan s držákem, deionizovaná voda.
Provedení:
Příprava kolony
Chromatografickou kolonu upevněte ve stojanu do svislé polohy.
Do zúžené výtokové části vložte malý chomáček vaty a kolonu uzavřete výtokovým
kohoutem.
Ze zbobtnalého gelu odstraňte dekantací většinu kapaliny nad povrchem gelu. Skleněnou
tyčinkou suspenzi lehce promíchejte a pomocí nálevky nalijte do připravené kolony.
Otevřete kohout na koloně a tekutinu nechte volně vytékat, dokud nad gelem nezůstane
asi 1 mm kapaliny. Pak kohout uzavřete. Do gelu se nesmí dostat vzduchové bubliny.
Příprava a nanesení vzorku
Do 0,1 ml dextranu blue ve zkumavce přidejte 2–3 kapky fenolové červeně a
promíchejte.
Obsah zkumavky naneste opatrně plastovou pipetkou na připravenou kolonu spouštěním
roztoku po stěně kolony.
Kohout na koloně otevřete a nechte roztok vsáknout. Do gelu se nesmí dostat vzduchové
bubliny.
Potom opatrně opláchněte stěny kolony několika kapkami deionizované vody a nechte
opět vsáknout. Do gelu se nesmí dostat vzduchové bubliny.
Eluce a separace
Na kolonu nalijte deionizovanou vodu až k hornímu okraji a pozorujte průběh dělení. Po
rozdělení směsi do zón kohout uzavřete.
"1 Vedle stručného popisu práce zakreslete schematicky polohu a zbarvení zón.
"2 Zdůvodněte chromatografické chování těchto látek.
"3 Navrhněte způsob izolace jednotlivých složek směsi.
Biochemický ústav LF MU 4. cvičení
30
Úkol 4.2 Adsorpční chromatografie listových barviv na tenké vrstvě silikagelu
V tomto modelovém úkolu sledujeme rozdělení listových barviv po aplikaci acetonového extraktu
zelených rostlin na tenkou vrstvu silikagelu.
Listová barviva jsou lipofilní pigmenty (vázané v membránových strukturách), účastnící se
fotosyntetických procesů a nacházející se v plastidech. Jejich význam spočívá ve schopnosti konvertovat
energii elektromagnetického záření na energii chemických vazeb. Rozlišujeme zelené chlorofyly, žluté až
červenohnědé karotenoidy a převážně modré fykobiliny.
Struktura chlorofylů (orb. 5-2) je podobná struktuře hemu v živočišných buňkách, obsahuje tetrapyrrolové
jádro s komplexně vázaným kationtem hořečnatým. Na čtvrtém pyrrolovém jádře je navázán alifatický
alkohol fytol, zodpovědný za lipofilní vlastnosti chlorofylu. Chlorofyly v rostlinách dělíme na chlorofyl a a
b, lišící se substituenty na ostatních pyrrolech. Chlorofyly snadno podléhají kyselé hydrolýze za vzniku
hnědavého feofytinu.
Karotenoidy jsou rostlinná barviva, která patří do skupiny isoprenoidů. Jsou obsaženy v mrkvi (karoteny),
rajských jablíčkách (lykopen), šípcích, paprikách i v dalších rostlinách. Nejrozšířenějším karotenoidem je
žlutý β-karoten, z xantofylů lutein a zeaxantin (obr. 5-3). Karotenoidy se neúčastní přímo procesu
fotosyntézy, jejich funkcí je ochrana fotosystémů před nežádoucími oxidacemi.
Strukturní vzorce chlorofylu a, b
Strukturní vzorce nejrozšířenějších karotenoidů
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
CH
3
CH
3
Zeaxantin
Lutein
CH
3
CH
3
OH
CH
3 CH
3
OH
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
β-Karoten
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
Chlorofyl a R = –CH
3
Chlorofyl b R = –CHO
N
NN
N
CH
2
CH
3
R
CH
3
CH
3
CH
3
OO
O
CH
3
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
Mg
31
Obecný postup při chromatografii na tenké vrstvě
Chromatografické desky bereme rukou za hrany, povrchu se nedotýkáme prsty.
Před nanášením vzorků označíme velmi lehce tužkou příčnou linii startu (nesmíme porušit
vrstvu silikagelu) ve vzdálenosti 15 až 20 mm od dolního okraje desky (při vyvíjení
nesmějí být vzorky ponořeny do mobilní fáze).
Ve vzdálenosti 10 až 15 cm od startu vyznačíme tužkou vzdálenost, kam při vlastní
chromatografii necháme vzlínat mobilní fázi (tzv. čelo mobilní fáze). Mezi jednotlivými
vzorky má být vzdálenost 10–15 mm, od bočních okrajů nejméně 15 mm.
Vzorky nanášíme mikropipetami nebo kapilárkami bez porušení tenké vrstvy. Průměr
skvrn (při nanášení na tečku), resp. šířka pruhu (při nanášení v pruhu) nemá být větší než
3 mm. Nanášíme postupně: skvrnu vždy vysušíme proudem vzduchu, např. z elektrického
vysoušeče, teprve pak naneseme další podíl vzorku.
Chromatografická komora se naplní do výše cca 1 cm vyvíjecí soustavou, uzavře se a
nechá se sytit parami mobilní fáze. Po vložení chromatografické desky komoru opět
uzavřeme.
Dosáhne-li čelo mobilní fáze žádané vzdálenosti (viz výše), deska se vyjme z komory a
usuší.
Materiál: Chromatografické desky Silufol 15 x 7,5 cm, elektrický vysoušeč, nanášecí kapiláry,
chromatografická komora, šablona k odečítání hodnot R
F
. Vyvíjecí směs (benzín : propan-2-ol :
voda 100 : 10 : 0,25, v/v/v), acetonový extrakt zelených listů.
Provedení:
Benzín je hořlavina I. třídy, v laboratoři se nesmí pracovat s otevřeným ohněm!
Desku připravte k nanášení vzorků podle předcházejících pokynů. Kapilárou naneste na
vrstvu v označeném místě vzorek acetonového extraktu.
Desky s vysušenými tečkami vzorků vložte do komory s mobilní fází a nechejte
potřebnou dobu vyvíjet, vyjměte a usušte. Rozdělené látky jsou výrazně zbarvené,
tužkou označte koncentrační maxima zón.
"4 Zaznamenejte údaje o chromatografické soustavě, schéma chromatogramu s barvou zón a
vypočtenými hodnotami R
F
.
"5 Vysvětlete vztah mezi strukturou látky a chromatografickým chováním. Porovnejte polohu
zón jednotlivých analytů ve směsi.
"6 Jakým způsobem byste vyhodnotili chromatogram kvantitativně?
Biochemický ústav LF MU 4. cvičení
32
Úkol 4.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
Seznamte se s uspořádáním a použitím kapalinového chromatografu.
"7 Zaznamenejte si údaje o demonstrované chromatografické metodě.
Stanovovaný analyt: Vzorek: Nanášený objem (µl):
Kolona – název: Výrobce:
Sorbent:
Rozměr kolony (délka×vnitřní průměr mm): Velikost zrnění (µm):
Mobilní fáze:
Průtok (ml/min): Tlak (MPa):
Vloženo: 26.05.2011
Velikost: 335,40 kB
Komentáře
Tento materiál neobsahuje žádné komentáře.
Mohlo by tě zajímat:
Skupina předmětu ABCH - Biochemie
Reference vyučujících předmětu ABCH - Biochemie
Copyright 2024 unium.cz