- Stahuj zápisky z přednášek a ostatní studijní materiály
- Zapisuj si jen kvalitní vyučující (obsáhlá databáze referencí)
- Nastav si své předměty a buď stále v obraze
- Zapoj se svojí aktivitou do soutěže o ceny
- Založ si svůj profil, aby tě tví spolužáci mohli najít
- Najdi své přátele podle místa kde bydlíš nebo školy kterou studuješ
- Diskutuj ve skupinách o tématech, které tě zajímají
Studijní materiály
Zjednodušená ukázka:
Stáhnout celý tento materiálBiochemický ústav LF MU 4. cvičení
20
CHROMATOGRAFIE
Chromatografie je jedna z nejvýznamnějších moderních analytických metod. Různé typy
chromatografických metod umožňují dělení, identifikaci a stanovení velkého počtu organických i
anorganických látek, včetně biomakromolekul.
K dělení jsou využity rozdíly fyzikálně chemických charakteristik dělených látek, např. velikost
molekul, tvar, polarita, náboj, těkavost, adsorpční vlastnosti, biospecifická interakce.
Základní komponenty každého chromatografického systému jsou:
• Stacionární fáze (tuhá látka, gel, nebo tuhá matrice na níž je imobilizována kapalina). Stacionární
fáze je v závislosti na způsobu uspořádání umístěna ve skleněné nebo kovové koloně nebo
nanesena v tenké vrstvě na skleněnou, kovovou nebo plastikovou desku (folii).
• Mobilní fáze (kapalina nebo plyn). Slouží jako nosná fáze pro vzorek, který je pomocí mobilní
fáze transportován podél (skrz) fázi stacionární.
• Systém umožňující pohyb mobilní fáze.
• Detekční systémy, umožňující vizualizaci testovaných substancí (absorpční spektrofotometrie,
fluorescence, coulometrie, konduktometrie, hmotnostní spektrometrie).
V průběhu chromatografie jsou látky dělené směsi unášeny mobilní fází a interagují s fází stacionární
s různě silnou intenzitou. Čím intenzivnější jsou interakce se stacionární fázi, tím pomaleji se látka
pohybuje. Na základě toho jsou látky směsi separovány a vytékají postupně z kolony nebo poskytují
oddělené zóny na tenké vrstvě.
Podle typu mobilní fáze rozlišujeme chromatografii kapalinovou (mobilní fází je kapalina) a
plynovou (mobilní fází je plyn). Ke speciálnějším chromatografickým metodám patří dále fluidní
chromatografie (mobilní fází je látka v nadkritickém stavu označovaná jako superkritická kapalina,
viskozitou blízká plynu a hustotou kapalině) a plazmová chromatografie (mobilní fází je proud iontů).
Na základě uspořádání chromatografického procesu rozlišujeme techniky planární (chromatografie na
papíru nebo na tenké vrstvě) a kolonové (sloupcové, separace probíhají v kolonách nebo v kapilárách).
Tenká vrstva adsorbentu Kolona
21
Kapalinová chromatografie
Základní principy uplatňující se v kapalinové chromatografii
Podle principu interakce mezi dělenými látkami a stacionární fází se rozlišují základní typy
chromatografie:
Typ chromatografie Princip dělení
Adsorpční Adsorpce na stacionární fázi
Rozdělovací Rozdělení mezi kapalnou fázi zakotvenou na stacionární tuhé fázi a
mobilní fázi
Typ chromatografie Princip dělení
Iontově výměnná Výměna kationtů nebo aniontů mezi funkčními skupinami navázanými
na stacionární tuhé fázi a komponentami vzorků
Gelová filtrace Dělení na základě velikosti molekul při průtoku stacionární fází
Afinitní Selektivní interakce mezi komponentami vzorku a specifickými ligandy
navázanými na inertní stacionární fázi
Adsorpční chromatografie
Stacionární fází je pevný, jemně zrněný adsorbent. Vzorek nanesený na adsorbent se při průtoku
mobilní fáze dělí na jednotlivé složky (sloučeniny) podle intenzity jejich vazebných interakcí
s adsorbentem a podle polarity mobilní fáze. Adsorbent neváže molekuly na celý svůj povrch, ale jen
na tzv. aktivní centra. Principem interakcí jsou nevazebné síly typu dipól-dipól, vodíkové vazby, van
der Waalsovy interakce, případně hydrofobní interakce. Nejrychleji je unášena sloučenina, která má
malou afinitu k adsorbentu a zároveň je nejlépe rozpustná v mobilní fázi. Je-li adsorbent polární
(nejčastěji silikagel nebo oxid hlinitý) a mobilní fází je nepolární organické rozpouštědlo (uhlovodík,
halogenalkan), putují adsorbentem nejrychleji nepolární složky. Polární jsou pevně adsorbovány
poblíž místa nanesení vzorku a k jejich eluci je třeba zvýšit polaritu rozpouštědla.
Je-li adsorbent nepolární (nejčastěji silikagel modifikovaný
navázáním delších uhlovodíkových zbytků – C-8, C-18),
používá se k eluci směs vodného pufru a polárního
organického rozpouštědla (methanol, acetonitril). Nejrychleji
jsou unášeny polární sloučeniny, nepolární látky jsou
zadržovány.
Modifikovaný silikagel
Biochemický ústav LF MU 4. cvičení
22
Rozdělovací chromatografie
Při rozdělovací chromatografii se látky dělí mezi dvě kapalné, navzájem nemísitelné fáze. Jednou
z nich je kapalina zakotvená (navázaná) na stacionární fázi, druhou je kapalná mobilní fáze. Proces
rozdělování lze zjednodušeně přirovnat k extrakci látky mezi dvě nemísitelné kapaliny při
protřepávání v dělicí nálevce. Jestliže má látka dělené směsi polární charakter, přechází více do
polárního rozpouštědla, naopak nepolární látky přejdou do rozpouštědla nepolárního. Kvantitativní
mírou rozdělení je rozdělovací koeficient. Obdobné procesy se odehrávají i při chromatografickém
dělení. Stacionární fází bývá obvykle vodná fáze (voda nebo pufr), která ve formě tenkého filmu
pokrývá povrch polárního adsorbentu (silikagel, celulosa, oxid hlinitý). Mobilní fáze, kterou je
organické rozpouštědlo, zprostředkovává pohyb dělené směsi přes fázi zakotvenou a ve vzájemném
kontaktu obou fází dochází k rozdělování látek směsi na principu extrakce. Mobilní fáze se obohacuje
o složky v ní dobře rozpustné, tj. nepolární, naopak v zakotvené fázi jsou zadržovány látky mající
charakter polární.
Velmi rozšířenou formou rozdělovací chromatografie byla dříve papírová chromatografie. Tato
metoda je však v současné době již používána málo. Uplatňuje se
dělení na kolonách a na tenkých vrstvách. Jako materiál pro
stacionární fázi se nejčastěji používá oxid hlinitý, silikagel, vláknitá
celulosa. Poněvadž tyto materiály mají současně i vlastnosti
adsorpční, může se při rozdělovací chromatografii částečně
uplatňovat i princip adsorpce a naopak při adsorpční chromatografii
může být dělení ovlivňováno i přítomností vody navázané na
nedokonale vysušeném sorbentu.
Iontově výměnná chromatografie
Stacionární fází při tomto typu chromatografie jsou měniče iontů (ionexy). Jsou to jemně zrněné
organické, méně často anorganické polymery s prostorově síťovitou strukturou. Na povrchu obsahují
četné funkční skupiny kyselé nebo zásadité povahy (viz též sorbenty používané při SPE). Měniče
kationtů (katexy) obsahují pevně vázané kyselé funkční skupiny, jejichž disociací (uvolněním tzv.
protiiontu) vznikají záporně nabité skupiny (–COO
−
, –SO
3
−
, fenolický –O
−
, apod). Měniče aniontů
(anexy) obsahují bazické skupiny, které se při určité hodnotě pH protonizují (váží na sebe z roztoku
ion H
+
) a stávají se kladně nabitými (kvartérní amoniová skupina –NR
4
+
,
–NH
3
+
, =NH
2
+
, apod.).
Částice iontoměniče vážou z roztoku určitý ion a přitom uvolňují do roztoku ekvivalentní množství
iontu stejného náboje, který byl původně vázán na ionexu.
Většina způsobů dělení na ionexech má dvě fáze. V první fázi se složky směsi navazují na ionex a ve
druhé fázi nastává postupné vytěsnění složek z ionexu a tím i jejich rozdělení. Postupné vytěsnění
navázaných látek z ionexu je umožněno odlišnou pevností vazby mezi vyměňovanými ionty a
funkčními skupinami ionexu. Pevnost vazby závisí na elektrických vlastnostech vázaných iontů. Ionty
se z ionexu uvolňují promýváním ionexu eluentem, ve kterém se mění koncentrace iontů, pH, iontová
síla, teplota, případně jiný parametr.
Ionty směsi se nahrazují postupně ionty eluentu a postupně vytékají z ionexu.
Uspořádání při papírové chromatografii
23
Gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
Při této metodě probíhá dělení látek na základě velikosti molekul. Dělícím materiálem je pórovitý gel.
Gel se získává bobtnáním (botnáním, přijímáním vody) vysušeného práškovitého materiálu, který
má vnitřní trojrozměrnou nebo síťovitou strukturu, která
zajišťuje pórovitý charakter. Velikost pórů závisí na typu gelu.
Bobtnáním se do pórů dostává rozpouštědlo. Roztok směsi
látek lišících se velikostí se nanese na povrch gelu. Gel
v koloně nebo na tenké vrstvě se promývá elučním roztokem
stejného složení jako je roztok v pórech gelu. Molekuly větší
než póry gelu nemohou pronikat do pórů a procházejí přes
kolonu stejnou rychlostí jako eluční roztok. Objeví se v eluátu
hned po vytečení první porce elučního roztoku. Malé molekuly
pronikají do pórů gelu. Tam eluční roztok neprotéká a neunáší
je. Pokud se difúzí dostanou ven z částice gelu, proud elučního
roztoku ji odnese k další částici gelu. Látky se rozdělují podle
zmenšujících se rozměrů molekul. Velké molekuly tedy procházejí kolonou rychleji, malé pomaleji. V
praxi se však také uplatňují další interakce mezi částicemi, např. adsorpční, polární, apod.
Gel v prášku se musí nechat nabobtnat v demi-vodě nebo v pufru, se kterým budeme pracovat.
Bobtnání trvá několik hodin. Aby se vytvořil homogenní gel, tak se jen velmi málo promíchává a
nepoužívá se magnetické míchadlo. Při intenzivním míchání by se mohla porušit matrice gelu. Objem
rozpouštědla použijeme aspoň dvakrát větší než bude mít gel po nabobtnání. Při laboratorní teplotě
trvá bobtnání podle typu gelu 2 až 72 hodin, při teplotě 90 °C trvá bobtnání 1 až 5 hodin.
Techniky kapalinové chromatografie
Z hlediska metody provedení rozlišujeme při kapalinové chromatografii dvě základní techniky:
chromatografii planární a kolonovu.
Planární chromatografie
Planární chromatografie patří mezi instrumentálně nejjednodušší techniky kapalinové chromatografie.
Zahrnuje papírovou chromatografii, která je v současné době na ústupu a používá se jen zřídka, a
chromatografii na tenkých vrstvách. Tenké vrstvy se připravují buď manuelně, nanášením
chromatografického materiálu na skleněnou podložku, mnohem běžnější jsou však komerčně
dodávané chromatografické desky. Jako stacionární fáze se nejčastěji používají sorbenty na bázi
silikagelu a oxidu hlinitého.
Vzorky se nanáší na spodní okraj desky na tzv. místa startu ve formě teček nebo čárek pomocí kapilár.
Tenká vrstva se umísťuje do nádobky nasycené parami mobilní fáze tak, že spodní okraj tenké vrstvy
je smáčen mobilní fází, která působením kapilárních sil mezi částicemi stacionární fáze vzlíná a tak
dochází k jejímu průtoku podél stacionární fáze. Látky směsi jsou unášeny mobilní fází a současně
interagují s povrchem fáze stacionární. Na základě afinity ke stacionární fázi zůstanou navázány
v určité vzdálenosti od místa startu. Po vysušení desky se barevné látky objeví ve formě skvrn v rů
Vloženo: 26.05.2011
Velikost: 335,40 kB
Komentáře
Tento materiál neobsahuje žádné komentáře.
Mohlo by tě zajímat:
Skupina předmětu ABCH - Biochemie
Reference vyučujících předmětu ABCH - Biochemie
Copyright 2023 unium.cz. Abychom mohli web rozvíjet a dále vylepšovat podle preferencí uživatelů, shromažďujeme statistiky o návštěvnosti, a to pomocí Google Analytics a Netmonitor. Tyto systémy pro unium.cz zaznamenávají, které stránky uživatel na webové stránce navštívil, odkud se na stránku dostal, kam z ní odešel, jaké používá zařízení, operační systém či prohlížeč, či jaký má preferenční jazyk. Statistiky jsou anonymní, takže unium.cz nezná identitu návštěvníka a spravuje cookies tak, že neumožňuje identifikovat konkrétní osoby. Používáním webu vyjadřujete souhlas použitím cookies a následujících služeb: